組換え酵素Creに依存した配列特異的レンチウイルスベクターの開発

レンチウイルスベクターは目的遺伝子を細胞染色体に組込むことができるので安定した発現が必要な場合に汎用されている。しかし、遺伝子を宿主細胞の染色体配列にランダムに組込んでしまうので、導入遺伝子が発現抑制を受けたり、感染細胞の癌化を引き起こしてしまう危険性が指摘されている。本研究では、ランダムな遺伝子の組込みを触媒している酵素であるインテグラーゼを欠損させた非組込み型レンチウイルスベクター粒子内に配列特異的組換え酵素Creを取り込ませることで、宿主細胞染色体の配列に特異的に遺伝子を組込むことが可能なレンチウイルスベクターを開発することを目的としている。本年度は、ウイルス粒子内にCreタンパク質を取り込ませるためのウイルスタンパク質と組換え酵素Creの融合タンパク質発現用プラスミドを作製した。また、Creとその認識配列であるloxP配列の反応を用いた遺伝子組込みの効率はloxP配列を構成しているアーム配列及びスペーサー配列に依存することがこれまでの研究成果により示唆されている。そこで、Creによる遺伝子組込みを効率的に行うために4種類のアーム配列と11種類のスペーサー配列を組み合わせた44種類のloxP配列のCreによる遺伝子組込み効率を測定することで組込み効率の高いloxP配列をスクリーニングすることを試みた。その結果、野生型のスペーサー配列と遺伝子組込みに汎用されているアーム配列(lox66/71)を組み合わせたloxP配列より約4倍高い組込み効率を示すloxP配列をスクリーニングすることができた。今後、作製したプラスミドを用いてレンチウイルスベクターを生産し、このウイルスベクターを用いて配列特異的に遺伝子を組込むことができるかどうかを検討する予定である。

レンチウイルスベクターは目的遺伝子を細胞染色体に組込むことができるので安定した発現が必要な場合に汎用されている。しかし、遺伝子を宿主細胞の染色体配列にランダムに組込んでしまうので、導入遺伝子が発現抑制を受けたり、感染細胞の癌化を引き起こしてしまう危険性が指摘されている。本研究では、ランダムな遺伝子の組込みを触媒している酵素であるインテグラーゼを欠損させた非組込み型レンチウイルスベクター粒子内に配列特異的組換え酵素Creを取り込ませることで、宿主細胞染色体の配列に特異的に遺伝子を組込むことが可能なレンチウイルスベクターを開発することを目的としている。本年度は、ウイルス粒子内にCreタンパク質を取り込ませるためのウイルスタンパク質と組換え酵素Creの融合タンパク質発現用プラスミドを作製した。また、Creとその認識配列であるloxP配列の反応を用いた遺伝子組込みの効率はloxP配列を構成しているアーム配列及びスペーサー配列に依存することがこれまでの研究成果により示唆されている。そこで、Creによる遺伝子組込みを効率的に行うために4種類のアーム配列と11種類のスペーサー配列を組み合わせた44種類のloxP配列のCreによる遺伝子組込み効率を測定することで組込み効率の高いloxP配列をスクリーニングすることを試みた。その結果、野生型のスペーサー配列と遺伝子組込みに汎用されているアーム配列(lox66/71)を組み合わせたloxP配列より約4倍高い組込み効率を示すloxP配列をスクリーニングすることができた。今後、作製したプラスミドを用いてレンチウイルスベクターを生産し、このウイルスベクターを用いて配列特異的に遺伝子を組込むことができるかどうかを検討する予定である。