神経管閉鎖におけるFkbp38分子機構の解明

点击翻译按钮获取中文摘要

FKBP38はイムノフィリンに属する分子シャペロンであり、細胞質で合成されたBcl-2やBc1-xLをミトコンドリアにリクルートし、アポトーシスを抑制する。我々は、Fkbp38ノックアウト(KO)マウスを作製したところ、このマウスは二分脊椎症(神経管閉鎖不全)を発症し生直後に死亡することがわかった。この二分脊椎症の詳細な分子メカニズムは現在のところ不明であるが、KOマウスではソニックヘッジホッグ(Shh)シグナルの下流が活性化されており、Shhシグナルの異常が二分脊椎症を引き起こす可能性がある。我々は生体内で実際にFKBP38に結合するタンパク質を網羅的に同定するため、Histidine-FLAGタグを付加したFKBP38をPrionプロモーター下流で脳に発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。このマウスの脳抽出液を二段階免疫沈降による精製を行い、質量分析によってFKBP38結合タンパク質を探索したところ、ANKMY2を同定した。In vivo及びin vitroのタンパク質結合実験より、FKBP38のN末端56アミノ酸とANKMY2のZn2+finger domainとが結合することが明らかとなった。MEF細胞においてANKMY2をノックダウンするとShhシグナルの減弱を認め、逆にANKMY2を過剰発現するとShhシグナルの増強を認めたため、ANKMY2がShhシグナルの正の制御因子である可能性が考えられた。さらにゼブラフィッシュの発生過程におけるankmy2の発現パターンをin situハイブリダイゼーションにより解析したところ、発生初期及び神経管領域での発現を認めた。モルフォリノオリゴヌクレオチドを用いてankmy2をノックダウンすると、Shhシグナルの阻害によって起こるU字型体節の表現型を認めた。さらに蛍光タンパク質の発現により生体内でShhシグナルの可視化が可能なTgゼブラフィッシュにおいてankmy2をノックダウンすると、蛍光シグナルの減弱を認めた為、ANKMY2はゼブラフィッシュ個体内においてもShhシグナルを正に制御することが示唆された。