第三世代弱毒痘瘡ワクチンLC16m8株の温度感受性と弱毒化メカニズムに関する研究

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細胞培養痘そうワクチンの製造承認株であるLC16m8株は,Lister株から低温馴化によりLC16株,LC16mO株を経由して樹立された株である.LC16mO株,LC16m8株のほぼ遺伝子配列を比較すると,両者の遺伝子配列の相違点は,B5R遺伝子の一塩基欠失変異以外には5塩基のみ異なることが明らかにされた.その一方で,LC16系統痘そうワクチンの親株であるLister株の塩基配列は,バリエーションのある多様なウイルス変異体の集合として存在していることが明らかにされた。ListerとLC16系統それぞれの遺伝子の安定性(変異が生じやすいのか,それとも安定なのか)が不明であった.Lister株とLC16mOからプラーククローニングによって得られたクローンについてそれぞれ複数回継代を行ない,継代前後で塩基配列を比較し遺伝子の安定性を検討した.どちらの株についても1継代目と7継代目を比較して塩基配列に変異が生じなかったことから,Lister株から得られたクローンとLC16mO株の遺伝的安定性は高いことが明らかにされた.LC16m8の温度感受性責任遺伝子を明らかにするために必要な組換えワクチニアウイルスを容易に作製するためのシステムを開発した.薬剤耐性遺伝子であるgpt遺伝子をgus A遺伝子とフュージョンタンパク質として発現する組換えワクチニアウイルスを作製した.この際,ワクチニアウイルスの変異導入あるいは,入れ替えたい遺伝子領域をgpt-gus A遺伝子の両側に重複させる.このような組換えベクタープラスミドをトランスフェクションした細胞にワクチニアウイルスを感染し,薬剤を添加した選択培地を用いて組換え中間体を選択する。次に薬剤を非添加培地で組換え中間体ウイルスを増殖させて,重複する遺伝子領域の相同組換えによりgpt-gus Aフュージョン遺伝子を脱落させて目的遺伝子を入れ替える方法である.