分裂酵母におけるミトコンドリアストレスへの応答機構の解析

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ミトコンドリアDNAに損傷を与える誘導系として、EcoRIとミトコンドリア移行配列の融合蛋白質(MTS-EcoRI)を発現誘導可能な分裂酵母株を作製した。我々は、MTS-EcoRI発現株が野生型株よりも長い経時寿命を有すことを見出した。寿命延長には、何らかの適応応答機構が介在するとの仮説を立て、その分子機構の解析を行っている。前年度までにオートファジー関連因子Atg1、Atg2、Atg8が、MTS-EcoRI発現株の寿命延長に必須であること、及びMTS-EcoRI発現株ではオートファジー活性が野生型株と比べて高いことを見出した。また、抗酸化剤を培地中に添加することにより寿命延長及びオートファジーの活性化が抑制されるとの結果を得たことから、活性酸素種がシグナルとして機能することが示唆された。本年度は、実際に過酸化水素処理によってオートファジーの活性が上昇することをGFP-Atg8発現株を用いたウェスタンブロッティング解析により見出した。また、RT-PCRの結果から過酸化水素処理で複数のオートファジー関連因子の発現量が上昇することを見出した。現在は低レベルの過酸化水素処理のみで寿命延長が誘導されるか検討している。さらに、野生型株においてAtg8を過剰発現することで実際に経時寿命の延長が誘導されることを見出した。次に、オートファジーによる分解の標的の探索を行った。MTS-EcoRI株では機能欠損を起こしたミトコンドリアが蓄積することから、ミトコンドリアを標的とした選択的オートファジーが誘導される可能性を検討した。ミトコンドリアのマーカー蛋白質とGFPの融合蛋白質を発現する株を用いて、ミトコンドリアの分解をウェスタンブロッティングにより解析したが、コントロールと比べて大きな差は見られなかった。このことから、MTS-EcoRI株で見られたオートファジー活性の上昇は、ミトコンドリアを標的とした選択的なものではなく、非選択的オートファジーによるものであると考えられる。現在、MTS-EcoRI株におけるオートファジー活性化の生理的な意義について検討を行っている。