イネ糖タンパク質NPPのプラスチド局在化メカニズムの解明

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イネNPPの糖鎖構造解析NPPを共発現させた培養細胞から精製した時と同様に、NPP1強発現植物の葉からパーコール密度勾配遠心法により葉緑体を単離した。葉の全タンパク質と葉緑体タンパク質ではCon Aレクチンの認識性が異なるため葉緑体単離は成功し、葉緑体以外の糖タンパク質の混在は少なかった。この葉緑体タンパク質を用いて、Con A SepharoseでNPP1を精製した。精製した葉緑体NPP1から遊離させた糖鎖をGlycoblotting法で、糖鎖を精製、さらに質量分析により糖鎖構造を解析した。葉緑体NPP1からは65種類のN結合型糖鎖が同定された。またそのうち56種類が複合型もしくは少マンノース型の糖鎖構造であった。これは細胞全体から精製した時と同様の結果を示し、NPPが細胞内ではほとんどプラスチドに局在していることを示し、NPPの局在メカニズムは、ERゴルジ体の小胞輸送によってほかの糖タンパク質と同様なシステムで、ゴルジ体で修飾され、輸送されてる。イネNPPのプラλチド輸送メカニズムの解析NPP1強発現にトランスゴノレジマーカー(ST-GFP)、をイネに導入し、電子顕微鏡により構造観察と抗GFP抗体による免疫電子顕微鏡観察を行った;NPP1/ST-GFP共発現イネでは、プラスチド内にゴルジ体の周りに存在した輸送小胞と同程度の電子密度を持った小胞が観察された。また、抗GFP抗体では、プラスチドの外膜に接触した小胞や内部にあった小胞の周りにに金粒子が観察された。このことは前年、NPP1強発現体で蛍光顕微鏡によりプラスチドからST-GFPのシグナルが観察されたことを支持し、より強くプラスチドに局在する糖タンパク質は、ゴルジ体の膜ごとプラスチド内へ輸送されていることを示唆している。