神経縫合後の過誤支配の発生を低下させる局所療法の開発

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CLP36結合蛋白同定野生型PC12細胞の1% Triton lysis bufferでホモジナイズし、可溶化蛋白の中からCLP36複合体を抗CLP36抗体(BD biosciences)-Dynabeads Protein G (Invitrogen)を用いて免疫沈降させた。この抗体が免疫沈降に使用できることは、すでに確認済みである(Tamura et al., BBRC 364:589-94, 2007)。沈降した蛋白群を0.5M NH_4OH, 0.5mM EDTAで溶出、SDS-PAGEによって分離・展開し、銀染色によってバンドとして可視化した。同時にコントロールとして、1)野生型PC12細胞に対しnormal IgGを使った免疫沈降、2)CLP36ノックダウンPC12細胞に対し抗CLP36抗体を使った免疫沈降、を施行し、これらの沈降産物との比較を行うことでCLP36複合体として現れている特異的なバンドを選び出した。CLP36結合蛋白と見做されたバンドを、銀染色したゲルから1mmのブロックとして切り出し、還元化、アルキル化した後、トリプシン(Promega)によるゲル内消化を加えた。得られたペプチドをゲルから抽出し、LC-MS/MSによるペプチド酸配列の同定を行った。その結果をもとに検索エンジンを使い、蛋白の本体を明らかにした。本成果を主に、Neuroscience Letters誌(2010)において発表した。