マウス網膜発生・再生におけるDicerリボヌクレアーゼの役割の解析

計画書に記載されている実験計画にほぼ従って研究は行われた。Dicer-floxed mouseから網膜をとりだし、器官培養を行い、培養過程のさまざまなタイミングでCreをエレクトロポレーションにより導入し、その影響を観察した。初年度に、Dicer-floxed mouseとDkk3-cr emouseをかけあわせたものから、網膜発生初期の細胞の生存にDicerが必須であることをみいだしていたが、発生中期、後期においても、網膜細胞の生存にDicerが必須であることをみいだした。分化については双極細胞のみが分化異常をおこし、この理由は今後の興味深い課題として継続して研究を続ける予定である。またnon-cell-autonoousな影響を検討するため、DicerをCreにより欠失させた細胞を、in vitroで野生型の細胞とまぜあわせ培養をおこなった。Dicer欠失の影響がDicerを欠失した細胞のみで観察され、周囲の細胞にはおよばなかったことから、Dicerの欠失はその細胞のみに影響することを明らかにした。初年度にDicer-floxed mouseから樹立したiPS細胞については、まずその未分化性の維持についてDicerの役割を検討するため、Creを導入するためのエレクトレポレーションの条件検定をおこなった。みいだした至適条件を用いて、Cre-EGFP発現プラスミドをiPSに導入し、導入細胞をEGFPを指標にセルソーターで単離し、そのコロニー出現率、コロニーの形状、などを検討しているが、細胞が生存できないのか、得られる遺伝子導入細胞の数が少なく、安定した結果がえられなかった。今後、タモキシフェンでCreを誘導できる系を導入し検討していくことを計画している。

計画書に記載されている実験計画にほぼ従って研究は行われた。Dicer-floxed mouseから網膜をとりだし、器官培養を行い、培養過程のさまざまなタイミングでCreをエレクトロポレーションにより導入し、その影響を観察した。初年度に、Dicer-floxed mouseとDkk3-cr emouseをかけあわせたものから、網膜発生初期の細胞の生存にDicerが必須であることをみいだしていたが、発生中期、後期においても、網膜細胞の生存にDicerが必須であることをみいだした。分化については双極細胞のみが分化異常をおこし、この理由は今後の興味深い課題として継続して研究を続ける予定である。またnon-cell-autonoousな影響を検討するため、DicerをCreにより欠失させた細胞を、in vitroで野生型の細胞とまぜあわせ培養をおこなった。Dicer欠失の影響がDicerを欠失した細胞のみで観察され、周囲の細胞にはおよばなかったことから、Dicerの欠失はその細胞のみに影響することを明らかにした。初年度にDicer-floxed mouseから樹立したiPS細胞については、まずその未分化性の維持についてDicerの役割を検討するため、Creを導入するためのエレクトレポレーションの条件検定をおこなった。みいだした至適条件を用いて、Cre-EGFP発現プラスミドをiPSに導入し、導入細胞をEGFPを指標にセルソーターで単離し、そのコロニー出現率、コロニーの形状、などを検討しているが、細胞が生存できないのか、得られる遺伝子導入細胞の数が少なく、安定した結果がえられなかった。今後、タモキシフェンでCreを誘導できる系を導入し検討していくことを計画している。