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動物細胞におけるオーキシン誘導デグロン法を応用した、合成生物学的遺伝学の創出

在动物细胞中应用生长素诱导降解决定子方法创建合成生物遗传学

基本信息

批准号：
11J02503
负责人：
西村浩平
金额：
$ 1.54万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J02503/
关键词：
MCM8 MCM9 相同組組換え AID法 Elg1 Homologous Recombinataion オーキシンデグロン遺伝学

项目摘要

申請者は昨年DNA複製因子として考えられていたMcm8そしてMcm9が複合体を形成し、DNA二本鎖架橋のダメージの際の相同組換え修復において機能することを見いだし、論文として発表した。本年はこのニワトリDT40細胞におけるMcm8-9の機能をさらに多面的に解析するために、Mcm8-9複合体の精製を行い、ニワトリDT40細胞からMcm8-9複合体を精製することに成功した。この精製した複合体について生化学的また構造学的な解析を進めるための準備を現在行っている。またMcm8,9の遺伝学的な解析をさらに行う上でMcm8, およびMcm9のコンディショナルミュータントを当研究室で開発されたAID法を用いてMcm8-aid, Mcm9-aid株を作成し、表現型を確認したところ、いずれの場合もノックアウト細胞と比べて表現型が弱くなっていた。この結果を受けて当初考えていたマウスES細胞におけるAIDミュータントの作成に先立ち、AID法における標的タンパク質の分解の更なる効率化を行うこととした。出芽酵母において研究を行い、分解誘導に必要なタグの大きさを従来の3分の1にまで縮小することに成功した。さらにこのタグを3つ連続してつなげることによって従来よりも高効率の分解を誘導することに成功した。この分解の効率化によって、解析の困難であったElg1の機能解析が可能となり、分解効率の効率化とElg1の解析結果を併せて、論文に発表した。

The applicant registered last year's DNA replication factor test, Mcm8 copy test, Mcm9 complex formation test, DNA replication, DNA replication, and so on. This year, the DT40 cell model Mcm8-9 has been successfully tested for multi-faceted analysis, Mcm8-9 complex sperm test, DT40 cell cycle Mcm8-9 cell cycle and Mcm8-9 gene fusion. In this paper, the analytical methods of biochemistry and biochemistry are introduced in detail. On the basis of the analysis of the Mcm8,9 system, the Mcm8 is available, and the AID method is used in the laboratory. The Mcm8-aid method is used in the laboratory, and the Mcm9-aid method is used to make sure that the cell size is lower than that of the table. The results show that in the first part of the test, ES cells were divided into AID cells in the first place, and the AID method was used to improve the efficiency of the system. Saccharomyces cerevisiae was used to study and decompose the yeast, and it was necessary to make sure that the yeast was successful in terms of 3 points and 1 point. We need to know that we are going to have a high rate of decomposition and that we will be successful. To analyze the results of Elg1 analysis, to analyze the results of Elg1 analysis, to analyze the results of the analysis of the results, the results of the analysis of the results of the analysis