哺乳類のテロメア結合蛋白質間相互作用の構造的基盤とテロメア調節機構

点击翻译按钮获取中文摘要

mPot1PBRとmTPPIRDの複合体作成と結晶化を行った。両者とも大量調製の条件は整っていたが、結晶化やその後の重原子誘導体の探索を考えると、一回の収量を改善しなければ後々での困難が予想された。そこで、発現に用いる大腸菌の宿主をいくつか検討し、1番発現量が良いものに宿主を切り替えて、1回の発現と精製で得られるタンパク質の量を改善した。続いて、両者の複合体形成に最:適なモル比を検討するためにm:Pot1PBRを35Sで標識し、これにmTPPIRDの濃度を変化させて加えていって、両者の複合体のシフトバンドが検出されるモル比をゲルシフト法で解析した。ここで得られた複合体を形成するのに適したmPot1PBRとmTPPIRDのモル比で複合体を形成させ、これの結晶化を試みた。両者の複合体の結晶を得るための結晶化条件の最適化に移る。まずは、複合体濃度をIgG濃度換算のBradford法で10mg/mlにして様々なバッファーを試してみた。複合体が沈殿を作ってしまうという問題が生じたのでこれに対する対処法を講じ、沈殿生成避けることができたが、未だ安定して多量の結晶を得られる条件が確定していない。結晶を再現性良く多量に得られる方法を確立することは大切なので、このステップは時間をかけて詰めていくことにした。一応結晶は得られることはあるので、得られた結晶を用いて重原子誘導体の探索も同時に行っている。一方で、MAD法が適応できる結晶が得られることを期待して、セレノメチオニンを含むタンパク質の調製に取り掛かった。普通のタンパク質の発現と同じように、発現条件の最適化を行い、続いて精製条件を最適化にとりかかる。中々、可溶性タンパク質として高い発現量が見込める条件が見つからないので、大腸菌の宿主を毒性タンパク質に強い宿主等に変えてみて今後も発現条件の最適化を進めていく。複合体の結晶構造を得ることができたら、ReverseTwoHyblid法によって、複合体形成に重要と見込まれたアミノ酸と得られた構造を見比べて変異を入れるアミノ酸を決定したい。