生体熱工学及び細胞生物学的手法を併用した成熟神経細胞の凍結融解挙動の解明

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生体凍結の応用である凍結保存では、細胞や組織の損傷・保存のメカニズムは未だ十分には解明されていない。一方、薬・毒物スクリーニングの発展につながると期待される成熟神経細胞の凍結・融解挙動の研究は未だほとんど行われていない。この背景において、本研究課題では、成熟した神経細胞の凍結・融解挙動、凍結・融解後の細胞の形態変化や生存性について、詳細な情報を得ることを目的とする。本年度は、平成23年度の実験結果から明らかとなった凍結・融解後の形態変化に関して、当該過程における細胞に対する環境因子として、浸透圧ストレスに注目し、それに曝した場合の細胞時系列変化や細胞骨格の変化を調べると共に、凍結・融解後の形態変化との比較・検討を行った。さらに、凍結・融解後の形態変化や生存性に対する、凍結保護物質添加の影響を調べた。具体的には以下のようである。1.NaCl濃度の濃縮・希釈において、神経突起は、高張状態で若干細くなり、希釈過程において数珠状化や短小化が生じた。細胞体は、高張状態で明確に収縮し、希釈過程で再膨張および球状化した。2.代表的な凍結保護物質であるDMSOを10%添加した生理食塩水中においては、DMSOを含まない場合に比べ、氷結晶は微細化し、凍結過程で細胞の脱水・収縮は軽減した。冷却速度が速い場合には、細胞内凍結が観察された。3.DMSOを10%添加した生理食塩水中における凍結・融解後、神経突起の数珠状化・短小化が若干見られるものの、DMSOを含まない場合に比べ、大きく減少した。4.DMSOを10%添加した生理食塩水中においては、DMSOを含まない場合に比べ、凍結・融解後のNeurofilament L(細胞骨格タンパク質)は、数珠状化や湾曲・たわみなどが軽減され、コントロールと同様に、突起に沿って均一に存在していた。5.DMSOを10%添加した生理食塩水中における凍結・融解後、冷却速度が0.5～3℃/minにおいて最も生存率が高く、より低い、または高い冷却速度においては生存率が減少した。