分断化された動物ミトコンドリアゲノムにおける複製と転写

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高等動物のミトコンドリアDNA (mtDNA)は、通常15～20kb程度の環状分子として存在し、13のタンパク質および12S、16S rRNA、22のtRNAをコードする遺伝子がある。転写開始点およびプロモーターは制御領域に局在し、両鎖合わせて2分子の連続したRNAとして転写されたのち分断化され、最終的にそれぞれの遺伝子ごとのmRNAができる。一方、コロモジラミ(Pediculus humanus)のmtDNAは、20種類の3kb未満の小さな分子に分かれている。そこで本研究は、(1)分断化された小分子mtDNAはそれぞれどのように複製するのか、(2)小分子mtDNAにコードされる遺伝子はどのように転写されるのか、(3)一つの大きなmtDNA分子と多数の小分子mtDNAでは、どちらが機能的に優れたシステムなのか、(4)小分子mtDNAのシステムはどのように進化したのか、を明らかにし、ミトコンドリアゲノムの機能と進化を解明する上で有用な情報を得ることを目的とした。平成25年度は、人工的なリンカーDNAを複製途中のmtDNA分子の5'末端に付着させ、その付着点を調べることによって複製の開始点を決定した。具体的には、リンカーDNAとmtDNAを、DNAリガーゼを用いて結合し、リンカーDNAおよび複製開始点近傍の遺伝子内に設計したプライマーを用いてPCRを行い、両プラィマー間の領域のDNA断片を増幅した。得られたDNA断片はプラスミドベクターを用いてクローニングし、得られた数多くのクローンについてDNA断片の塩基配列を決定し、リンカーDNAの付着点を決定した。その結果、20種類全ての小分子mtDNAについて、メジャー鎖、マイナー鎖の両鎖の複製開始点の決定に成功した。マイナー鎖の複製開始点は、いずれの小分子においても、コード領域の200-300bp下流にあることが分かった。一方、メジャー鎖の複製開始点は、いずれの小分子においてもマイナー鎖の複製開始点の600-650bp下流にあることが分かった。そのすぐ上流にはステムーループ構造を取る配列が全ての小分子間で保存されており、この構造がメジャー鎖の複製開始に重要な役割を果たしていることが予想された。