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生合成遺伝子の汎用的異種発現による糸状菌ポリケタイド合成酵素の触媒機構の解明

通过生物合成基因的通用异源表达阐明丝状真菌聚酮合酶的催化机制

基本信息

批准号：
12J02831
负责人：
藤居瑠彌
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、麹菌異種発現系を利用し、酸無水物型二量体天然物であるphomoidride Bの骨格構築機構を解明することを目的とした。酸無水物型二量体天然物の骨格構築には、二つのモノマーが二量化することが予想されていたが、統一的に説明できる二量化機構は提唱されていなかった。そこで、本研究では、モノマーの生合成機構を解明し、続いて二量化酵素の探索を検討した。初めに、phomoidride Bの生産菌のゲノムＤＮＡを解析し、モノマーの予想生合成経路を基に、候補となる生合成遺伝子を探索した。その結果、ポリケタイド合成酵素(PKS)、縮合酵素(CS)、脱水酵素(MCD)が近接する遺伝子クラスター(phiクラスター)を発見した。これらの酵素遺伝子を麹菌に同時に導入したところ、培養した菌体の抽出物からは、予想モノマーの脱炭酸体が得られた。このことからphiクラスターがphomoidride Bの生合成に関与することを支持するとともに、宿主内で生成した中間体が脱炭酸したものと考えられた。次に、二量化前の真のモノマーを特定するため、大腸菌発現系を用いて、CSとMCDを調製した。基質には、α,β‐不飽和脂肪酸のCoAエステルを用い、オキサロ酢酸を加えてin vitro試験を行った結果、脱炭酸前のモノマーが得られた。これにより、CSとMCDの生成物はカルボン酸であり、脱炭酸反応を鍵として二量化が進行するという仮説が、初めて実験的に支持された。これらの実験事実と過去の研究を基に、二量化の機構を提唱した。これまでの研究では、同じモノマーが二量化すると考えられていたが、本研究で突き止められたカルボン酸モノマーAとそれが脱炭酸した二種のモノマーB、Cの組み合わせで二量化が進行するという仮説を新たに提唱した。この仮説はすべての二量体型酸無水物の生合成に適用可能な普遍的なものと考えている。

The purpose of this study is to understand the purpose of this study, which is to utilize the acid-anhydrous type two-dimensional natural product and to construct the structure of the skeleton of the fungus heterogeneous system. Acid anhydrous type two-dimensional natural substance の lattice structure には、二つのモノマーが二quantity することがI think of it, and the unified explanation of it is a quantitative mechanism.そこで, this research is では, モノマーの生SYNTHESIS を Explain し, 続いて二quantification enzyme のExploration を検 Discussion した. Initial analysis, phomoidride B production bacteria analysis, モノマーのyuxiangsheng synthesis 経路をbase, and candidate となる生 synthesized 缝子をExploration. The results of その, ポリケタイド synthesis enzyme (PKS), condensation enzyme (CS), dehydration enzyme (MCD) are close to each other. At the same time, the fermented enzymes are introduced into the koji bacteria, the extracts of the cultured bacteria are introduced, and the decarboxylic acid body of the yokan モノマー is obtained.このことからphiクラスターがphomoidride B's biosynthesis and decarbonization support decarbonization and decarbonization of intermediates in the host. Secondary, second quantitative pre-quantification specific reagent, coliform present system sterilization, CS とMCD を modulation したBase には, α,β-unsaturated fatty acid のCoA エステルを Use い, オキサロ酢颢add えてin The results of the in vitro test and the results of the test before decarbonization are the same.これにより, CSとMCD product はカルボン acid であり, decarboxylic acid reaction をThe key is the second quantification of the key and the support of the first key.これらの実験事実と Past の Research を Foundation に, Two quantified の Mechanism を Prompt singing した.これまでの研究では、同じモノマーが二quantificationするとtestえThis research is based on the researchマーAとそれがDecarbonationした二のモノマーB, Cの集团み合わせで二quantificationが carried out するという仮说を新たに提声した. It is possible to apply the biosynthetic synthesis of two-dimensional acid anhydrous substances to the common Nakano test.