アゼチジン-2-カルボン酸加水分解酵素を題材とした酵素反応の構造生物学的研究

基于氮杂环丁烷-2-羧酸水解酶的酶促反应的结构生物学研究

• 批准号: 12J04074
• 负责人: 豊田 真悠子
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J04074/
• 关键词: タンパク質; X線回折; 結晶構造解析; 酵素; 中間体

L-アゼチジン-2-カルボン酸加水分解酵素(以下、A2CH)を用いた蛍光光度分析前年度に引き続いて、A2CHとその基質L-アゼチジン-2-カルボン酸(AZC)の相互作用を解析するための研究を行った。まず、溶液状態のA2CHを波長295nmの光で励起して、内在するTrp残基に由来する蛍光を観察した。0.01～0.1MのAZC存在下で野生型A2CH溶液の蛍光光度測定を行ったところ、AZC濃度の上昇につれて蛍光強度の減少が見られた。これは、基質との相互作用によって触媒部位周辺の微小環境が変化することを示すと考えられた。一方、基質アナログのL-プロリンを同様にして加えた場合には、蛍光強度はあまり変化しなかったことから、A2CHとL-プロリンとの相互作用は基質に比べて非常に弱いことが推定された。L-アゼチジン-2-カルボン酸加水分解酵素(以下、A2CH)を用いたX線結晶構造解析前年度作製した変異体に比べて酵素全体の構造へ変異が与える影響がより小さい、新たな変異体W20F, H184A, T16Vを作製した。このうち結晶化に成功したW20F, H184AについてはX線構造解析を行った。いずれも全体的な構造は野生型に相似していた。これまでに得られたA2CHの構造では、触媒部位の入りロ付近にあるTrp20の側鎖、および残基番号204-211のループ領域(リッドループ)が、基質の有無によって異なる構造をとることが分かっていた。しかし、H184Aのアポ酵素の構造では、Trp20の側鎖やリッドループが複合体型構造をとっていた。また、W20Fの構造は、変異部分Phe20の側鎖に揺らぎが見られ、H184Aと同じく基質が入っていないにもかかわらずリッドループがふさがっていることが分かった。このことから、W20F, H184Aともに基質認識に重要な役割を担っているのではないかと考えられた。

L - ア ゼ チ ジ ン - 2 - カ ル ボ ン acid hydrolysis enzyme (" を, A2CH) with い た 蛍 photometric analysis before the annual に led light き 続 い て, A2CH と そ の matrix L - ア ゼ チ ジ ン - 2 - カ ル ボ ン acid (AZC) の interaction を parsing す る た め の を line っ た. ま ず and solution state の A2CH を wavelength of 295 nm light の で wound up し て, inner す る Trp residue に origin す る 蛍 light を 観 examine し た. The presence of 0.01 ~ 0.1 M の AZC で wild-type A2CH solution の 蛍 light photometry を line っ た と こ ろ rising, concentration of AZC の に つ れ て 蛍 light intensity の reduce が see ら れ た. こ れ は, matrix と の interaction に よ っ て catalyst sites weeks 辺 の が tiny environment - the す る こ と を shown す と exam え ら れ た. One party, the matrix ア ナ ロ グ の L - プ ロ リ ン を with others に し て plus え た occasions に は, 蛍 light intensity は あ ま り variations change し な か っ た こ と か ら, A2CH と L - プ ロ リ ン と の は interaction matrix に than べ て very weak に い こ と が presumption さ れ た. L - ア ゼ チ ジ ン - 2 - カ ル ボ ン acid hydrolysis enzyme (" を, A2CH) with い た X-ray crystal structure before the annual cropping し た - variant に than べ all の て enzyme structure へ - different が and え る influence が よ り small さ い, new た な - W20F, H184A, T16V を cropping し た. <s:1> うち crystallization に successful た たW20F, H184Aに った て て X-ray structure analysis を lines った. The overall な structure of the ずれ ずれ is similar to that of the wild type に and the <s:1> て た た た. こ れ ま で に have ら れ た A2CH の tectonic で は, catalyst sites の り ロ paying nearly に あ る Trp20 の side lock, お よ び residues serial number 204-211 の ル ー プ areas (リ ッ ド ル ー プ) が, matrix の presence of に よ っ て different な る tectonic を と る こ と が points か っ て い た. The structure of the アポ enzyme <s:1> of the <s:1> アポ of <s:1>, the で で of the <s:1> side lock of Trp20, the やリッド やリッド of the <s:1> アポ and the プが complex structure of をとって をとって た た た. ま た, W20F は の structure, - different parts Phe20 の side chain に 揺 ら ぎ が see ら れ, H184A と with じ く matrix が っ て い な い に も か か わ ら ず リ ッ ド ル ー プ が ふ さ が っ て い る こ と が points か っ た. こ の こ と か ら, W20F H184A と も に matrix know に cut を bear important な service っ て い る の で は な い か と exam え ら れ た.

项目成果

複合体結晶構造に基づくアゼチジン-2-カルボン酸加水分解酵素の反応機構

基于复杂晶体结构的氮杂环丁烷-2-羧酸水解酶的反应机理

• 发表时间: 2013
• 作者: 豊田真悠子;実森啓二;WACKETT Lawrence P.;江崎信芳;栗原達夫;三上文三
• 通讯作者: 三上文三