非酵素的アミド結合切断を基盤とした標的タンパク質精製への挑戦

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本研究では、プロテオーム中にある標的タンパク質の高効率的精製および選択的ラベル化を可能とするトレーサブルリンカーの開発を目的とする。トレーサブルリンカーとは、任意の条件下で切断され、その結果生じる官能基を足がかりとして再び機能性ユニットの導入が可能なリンカーと定義する。本研究で開発予定のトレーサブルリンカーは、申請者が開発したフッ化物イオンに応答してアミド結合切断を誘起する人工アミノ酸を利用することにより、フッ化物イオン処理による切断が可能である。さらに、リンカー切断後にアミノオキシ基が再生するよう設計することにより、アルデヒド含有ラベル化試薬の選択的導入が可能となる。本研究は、酵母由来エノラーゼのシステイン残基を既知法に従ってアルキニル化したものをモデルタンパク質として用い、以下の手順に従って進めることとした。1、トレーサブルリンカーとのクリックケミストリーによりエノラーゼをビオチン化する。2、ビオチン化エノラーゼをアビジンカラムに吸着させる。3、フッ化物イオン処理によるトレーサブルリンカーの切断に伴いエノラーゼを溶出させる。4、溶出エノラーゼを選択的に蛍光ラベル化する。申請者は今年度、チオール処理によって切断可能であり、またリンカー長や剛直性の異なる三種類の新規改良型トレーサブルリンカーを開発し、アルキニル化エノラーゼを用いた実験について検討を行なった。その結果、前年度にフッ化物イオン応答型トレーサブルリンカーを用いた場合に問題となっていたリンカーの導入効率とアビジンビーズからの溶出効率を向上させることに成功した。さらに、三種類のタンパク質混合物からの標的タンパク質の精製および選択的ラベル化も達成した。