気孔の光合成依存的二酸化炭素応答メカニズムの解析

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1. ツユクサ表皮のプロトンポンプのWestern blotting気孔開口を促進する葉肉シグナルは孔辺細胞膜プロトンポンプをリン酸化して活性化する可能性がある．ツユクサ表皮が葉肉組織と接触している場合に，孔辺細胞膜プロトンポンプがリン酸化されるかを解析するため，プロトンポンプのリン酸化レベルの解析を行うことにした．ツユクサの剥離表皮を集め，プロトンポンプのWestern blottingを試した．名古屋大学の木下研究室では，孔辺細胞プロトプラストを用いたプロトンポンプのWestern blottingが盛んに行われている（e.g. Hayashi et al., PCP, 2010）この手法を参考にして，ツユクサのプロトンポンプのWestern blottingを行うことにした．ツユクサには，丁寧に表皮を剥離すると，剥離表皮に葉肉組織が混入しないという利点がある．したがって，ツユクサの場合には，剥離表皮でWestern blottingを行うことで，孔辺細胞膜プロトンポンプのリン酸化レベルを解析できると期待される．Western blottingを行うことで，ツユクサの細胞膜プロトンポンプを検出できるようになった．2. 葉肉アポプラストシグナルの分子サイズの推定ツユクサの剥離表皮と葉肉組織の間に，透析膜を挟み，気孔の応答を観察した．透過可能な分子の分子量の上限が，100～500の範囲にある透析膜を挟んだ場合には，気孔開口は抑制されなかった．一方，気孔閉鎖は抑制され，閉鎖速度が遅くなった．したがって，気孔開口を促進する葉肉シグナルの分子量は100よりも小さく，気孔閉鎖を促進する葉肉シグナルの分子量の範囲は100～500であると推定された．この研究結果から，葉肉シグナルの同定を行う上で，葉肉シグナルの候補物質を大幅に絞り込こめるようになると期待される．