Dicerによる小分子RNA産生の構造的基盤

本研究課題はRNaseIIIタンパク質であるDicerについて、昆虫Dicer-1、Dicer-2、またはヒトDicerの全長またはhelicaseドメインの結晶構造解析を行うことで、RNAi経路における小分子RNA生合成過程の分子基盤を明らかにすることを目的としている。前年度までにコクヌストモドキTribolium castaneumのDicer-1、Dicer-2について、SUMOタグを用いた発現・精製系を確立した。得られたタンパク質を用いた結晶化スクリーニングをおこない、RNAやATPなどとの共結晶化を試みるなど数多くの結晶条件を試行したものの、結晶は得られなかった。また、並行して進めていた昆虫細胞によるDicer全長の発現系についてコンストラクトの改良を行い、ネッタイシマカAedes aegypti及びショウジョウバエDrosophila melanogasterのDicer-1、Dicer-2について結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。また、前年度時点での展望として、結晶構造解析に加えて電子顕微鏡による構造解析を行うことを検討していた。本年度において申請者は、共同研究者の指導のもと、電子顕微鏡の操作や得られた画像の解析等のトレーニングを行ったが、Dicerを用いた単粒子解析は行えていない。これについては、申請者は来年度に共同研究先の研究室において博士研究員として雇用されることが決定しており、来年度以降に引き続き研究を続けていく予定である。

本研究課題はRNaseIIIタンパク質であるDicerについて、昆虫Dicer-1、Dicer-2、またはヒトDicerの全長またはhelicaseドメインの結晶構造解析を行うことで、RNAi経路における小分子RNA生合成過程の分子基盤を明らかにすることを目的としている。前年度までにコクヌストモドキTribolium castaneumのDicer-1、Dicer-2について、SUMOタグを用いた発現・精製系を確立した。得られたタンパク質を用いた結晶化スクリーニングをおこない、RNAやATPなどとの共結晶化を試みるなど数多くの結晶条件を試行したものの、結晶は得られなかった。また、並行して進めていた昆虫細胞によるDicer全長の発現系についてコンストラクトの改良を行い、ネッタイシマカAedes aegypti及びショウジョウバエDrosophila melanogasterのDicer-1、Dicer-2について結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。また、前年度時点での展望として、結晶構造解析に加えて電子顕微鏡による構造解析を行うことを検討していた。本年度において申請者は、共同研究者の指導のもと、電子顕微鏡の操作や得られた画像の解析等のトレーニングを行ったが、Dicerを用いた単粒子解析は行えていない。これについては、申請者は来年度に共同研究先の研究室において博士研究員として雇用されることが決定しており、来年度以降に引き続き研究を続けていく予定である。