アセチルコリン合成酵素の細胞核内機能の解明

アセチルコリン合成酵素(ChAT)の細胞核内機能の解明のために、アセチルコリン合成酵素によるコリントランスポーターの転写誘導にプロモーター部位の状態がどう関わっているかを検討した。アセチルコリン合成酵素がプロモーター付近に結合するかはクロマチン沈降法では絞り込むことが出来なかった。そこで、アセチルコリン合成酵素強制発現の有無によるコリントランスポーター遺伝子上流のGpCアイランドのDNAメチル化の検討を行った。バイサルファイトシークエンス法を用いて、アセチルコリン合成酵素の強制発現の有無によるメチル化を比較した。ChAT-GFPとGFP安定発現のSH－SY5Yで比較したところ、DNAのメチル化はいずれも少なく、SH-SY5Yでは、コリントランスポーター遺伝子は、もともと転写されやすい開いた状態にあるものと考えられた。アセチルコリン合成酵素の強制発現では、DNAメチル化は変化していないという結果であった。コリントランスポーター転写誘導が、多段階でおこっている可能性が考えられ、アセチルコリン合成酵素の発現の影響化にある遺伝子を、Tet-on ChAT発現SH-SY5Yを材料に、ドキシサイクリンの有無で回収したRNAを用いて、DNAアレーで検討した。得られた候補遺伝子ついて、リアルタイムPCRを行ったところ、アセチルコリン合成酵素発現で確実に増加したのが、毛様体神経栄養因子（CNTF）およびc-FOS、一方減少していたのは、NELL2というprotein kinase C-binding proteinであった。とくにNELL2についてはこれまで知見が少ないため、抗体を入手して脳内のChATとの共存状態の検討に着手した段階で研究を終えた。最終年に研究代表者が、短期間で非研究機関に転出したため、研究を廃止した。

アセチルコリン合成酵素(ChAT)の細胞核内機能の解明のために、アセチルコリン合成酵素によるコリントランスポーターの転写誘導にプロモーター部位の状態がどう関わっているかを検討した。アセチルコリン合成酵素がプロモーター付近に結合するかはクロマチン沈降法では絞り込むことが出来なかった。そこで、アセチルコリン合成酵素強制発現の有無によるコリントランスポーター遺伝子上流のGpCアイランドのDNAメチル化の検討を行った。バイサルファイトシークエンス法を用いて、アセチルコリン合成酵素の強制発現の有無によるメチル化を比較した。ChAT-GFPとGFP安定発現のSH－SY5Yで比較したところ、DNAのメチル化はいずれも少なく、SH-SY5Yでは、コリントランスポーター遺伝子は、もともと転写されやすい開いた状態にあるものと考えられた。アセチルコリン合成酵素の強制発現では、DNAメチル化は変化していないという結果であった。コリントランスポーター転写誘導が、多段階でおこっている可能性が考えられ、アセチルコリン合成酵素の発現の影響化にある遺伝子を、Tet-on ChAT発現SH-SY5Yを材料に、ドキシサイクリンの有無で回収したRNAを用いて、DNAアレーで検討した。得られた候補遺伝子ついて、リアルタイムPCRを行ったところ、アセチルコリン合成酵素発現で確実に増加したのが、毛様体神経栄養因子（CNTF）およびc-FOS、一方減少していたのは、NELL2というprotein kinase C-binding proteinであった。とくにNELL2についてはこれまで知見が少ないため、抗体を入手して脳内のChATとの共存状態の検討に着手した段階で研究を終えた。最終年に研究代表者が、短期間で非研究機関に転出したため、研究を廃止した。