高熱安定性シトクロムｃを利用した生体内タンパク質高次構造体形成の機構解明と制御

昨年度実施した研究により、野生型好熱菌cyt c552は大腸菌内でドメインスワップ多量体を形成することが分かった。そこで本年度は、タンパク質の精製を簡便にしより詳しく多量体形成について調べるため、昨年度構築したC末端にHis-tagを付加した好熱菌cyt c552の発現系を用いた。タンパク質発現量と多量体形成の関係について調べるため、His-tagを付加した好熱菌cyt c552の発現系を有する大腸菌を培養し、培養途中の培養液を一部取り出して発現量と多量体形成量を調べた。菌体1 g当たりの好熱菌cyt c552の発現量は培養5時間から12時間の間に増え、その後も緩やかに増加した。一方全タンパク質中に占める多量体の割合も培養5時間から12時間の間に増加した。この結果より細胞内のタンパク質濃度が上昇すると多量体の割合が増加することが分かった。次に、タンパク質の安定性と多量体形成の関係を調べた。好熱菌cyt c552安定化に寄与しているアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変異体（I76V、A5F/M11V、Y32F/Y41E、A5F/M11V/Y32F/Y41E/I76V）は野生型より安定性が下がると報告されている。本研究ではHis-tagを付加した野生型および4つの変異体について、それぞれを大腸菌内に発現させ、抽出後HisTrapカラムで分析し、多量体形成量を比較した。その結果、二量体より大きな高次多量体が占める割合はタンパク質の安定性が低くなるほど減少した。この結果よりタンパク質の安定性も細胞内でのタンパク質多量体形成に影響する因子の一つであることが示された。

昨年度実施した研究により、野生型好熱菌cyt c552は大腸菌内でドメインスワップ多量体を形成することが分かった。そこで本年度は、タンパク質の精製を簡便にしより詳しく多量体形成について調べるため、昨年度構築したC末端にHis-tagを付加した好熱菌cyt c552の発現系を用いた。タンパク質発現量と多量体形成の関係について調べるため、His-tagを付加した好熱菌cyt c552の発現系を有する大腸菌を培養し、培養途中の培養液を一部取り出して発現量と多量体形成量を調べた。菌体1 g当たりの好熱菌cyt c552の発現量は培養5時間から12時間の間に増え、その後も緩やかに増加した。一方全タンパク質中に占める多量体の割合も培養5時間から12時間の間に増加した。この結果より細胞内のタンパク質濃度が上昇すると多量体の割合が増加することが分かった。次に、タンパク質の安定性と多量体形成の関係を調べた。好熱菌cyt c552安定化に寄与しているアミノ酸を別のアミノ酸に置換した変異体（I76V、A5F/M11V、Y32F/Y41E、A5F/M11V/Y32F/Y41E/I76V）は野生型より安定性が下がると報告されている。本研究ではHis-tagを付加した野生型および4つの変異体について、それぞれを大腸菌内に発現させ、抽出後HisTrapカラムで分析し、多量体形成量を比較した。その結果、二量体より大きな高次多量体が占める割合はタンパク質の安定性が低くなるほど減少した。この結果よりタンパク質の安定性も細胞内でのタンパク質多量体形成に影響する因子の一つであることが示された。