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ｉＰＳ　細胞から角膜内皮細胞への分化誘導および新規角膜再生医療法の開発

iPS细胞向角膜内皮细胞的诱导分化及角膜再生医学新方法的开发

基本信息

批准号：
15J00329
负责人：
愛新覚羅維
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J00329/
关键词：
iPS 角膜内皮分化誘導

项目摘要

ヒト角膜内皮細胞(HCEC)はポンプ機能とバリア機能によって角膜の透明性を保持している。HCECは胎生期の神経堤幹細胞(NCSC)に由来し、損傷を受けると不可逆的に減少してしまい、失明にも至る水疱性角膜症という病態に陥る。水疱性角膜症に対して従来献眼による角膜移植が行われてきたが、ドナー不足と術後の拒絶反応が大きな問題となっている。本研究の目的は患者自身の末梢血単核球から樹立したiPS細胞をHCECに分化誘導し、移植可能な細胞シートを作製して移植に供するという画期的な角膜再生治療法を開発することである。本研究ではまず末梢血単核球からのiPS細胞の樹立および多能性確認、iPS細胞からHCECの前駆細胞であるNCSCへの分化誘導および確認、誘導されたNCSCの純化、NCSCからHCEC様細胞への誘導を成功させた。また、ATRA、Asc-2P、TGF- β2、bFGF、SB431542、Y27632等HCECの分化・増殖に関わるサイトカインや化合物を添加した培地でHCECの前駆細胞であるNCSCを培養することにより、NCSCからHCEC様細胞への分化誘導条件を成功させた。さらに誘導されたHCEC様細胞の角膜内皮マーカーの発現をrealtime PCRで確認したところ、一部の細胞においてCol8A2、Col4A2、SLC4A4、CDH2の遺伝子発現を認めた。また抗ZO-1抗体、抗Na+/K+ ATPase抗体、抗SLC4A4抗体、抗Col8A2抗体を用いる免疫染色を行ったところ、一部の細胞において陽性発現を認めた。誘導されたHCEC様細胞の懸濁液を用いて誘導HCEC様細胞シートを作製し、コラーゲンシート、培養角膜内皮シートとNa/K ATPaseポンプ機能を比較した。誘導HCEC様細胞シートはコラーゲンシートより高いポンプ機能が認められたが、培養角膜内皮シートより有意に低かった。

The corneal endothelial cell (HCEC) was used to determine the transparency of the cornea. During the fetal period of HCEC, the origin of NCSC, irreversible blindness, blindness to vesicular keratosis. Patients with vesicular keratosis were treated with keratoplasty and then refused to respond to severe keratoplasty problems. Objective in this study, patients' own peripheral blood nuclear globules were used to guide the differentiation of iPS cells into HCEC cells, and the transplantation was performed during the period of corneal regeneration for the treatment of corneal regeneration. In this study, peripheral blood nuclear globules, iPS cells, pluripotency confirmation, iPS cells, HCEC cells, NCSC cells, cells. HCEC, ATRA, Asc-2P, TGF- β 2, bFGF, SB431542, Y27632, etc., differentiate, colonize, culture, differentiation, differentiation, The corneal endothelium of HCEC cells were detected by realtime PCR, and the samples of Col8A2, Col4A2, SLC4A4 and CDH2 were confirmed by CDFI. Anti-ZO-1 antibody, anti-Na+/K+ ATPase antibody, anti-SLC4A4 antibody and anti-Col8A2 antibody were detected by immunostaining. The HCEC cell culture fluid was used to compare the mechanical properties of Na/K ATPase cells by using the direct HCEC cell culture device, which was used to detect the corneal endothelium. It is necessary to direct the HCEC cells to induce a low temperature. The higher the temperature, the higher the temperature. The higher the temperature, the lower the temperature.