海洋窒素循環に寄与するアンモニア酸化古細菌の生態特性評価

1.qPCRによるamoAとureCの分布特性の把握: 各海域試料からDNA を抽出し、その中のamoA 遺伝子、ureC 遺伝子のコピー数を定量PCR法で測定した。各遺伝子コピー数から、単位海水試料当たりの各微生物の現存量を定量的に算出し、AOA や他の細菌の分布構造を明らかにした。さらにamoA とureC 遺伝子の海域毎、深度毎の分布を比較し、AOA のどのくらいがureC 遺伝子を持つのを推測し、分布構造に影響を及ぼす環境因子について解析した。2.逆転写定量PCR によるamoAとureC 遺伝子の転写活性の測定: 各海水試料からmRNA を抽出し、一般的な逆転写プライマーを用い、逆転写PCR 法でcDNA を作った。その後a.と同様に、定量PCR 法により遺伝子のコピー数を測定し、それぞれのcDNA コピー数から、単位海水試料当たりの各遺伝子の転写活性を定量的に把握した。さらにcDNA とDNA のコピー数を比較することで転写率が高い場所の特定と環境因子との関係解析を行った。同時にureC の転写活性も測定することで、AOA が実際に尿素を利用している可能性について検討した。3.次世代シーケンス法によるメタゲノム解析: 北極海で得られた水深100 mと1000 mの試料から、それぞれのDNAを抽出、精製し、得られたDNAを断片化した。その後、DNAフラグメントに特定アダプターを付加し、サイズセレクションを行った。同じ長さのDNAフラグメントをPCRで増幅し、ライブラリーピュリフィケーションを行った後、Illumina社製Hi-Seq次世代シーケンサーでシーケンシングを行った。得られたメタゲノムデータについて初期解析を行い、その結果をこれまで定量PCR及びクローンライブラリー法で得られた結果と比較することで、北極海表層及び深層での微生物多様性を全面的に把握した。

1.qPCRによるamoAとureCの分布特性の把握: 各海域試料からDNA を抽出し、その中のamoA 遺伝子、ureC 遺伝子のコピー数を定量PCR法で測定した。各遺伝子コピー数から、単位海水試料当たりの各微生物の現存量を定量的に算出し、AOA や他の細菌の分布構造を明らかにした。さらにamoA とureC 遺伝子の海域毎、深度毎の分布を比較し、AOA のどのくらいがureC 遺伝子を持つのを推測し、分布構造に影響を及ぼす環境因子について解析した。2.逆転写定量PCR によるamoAとureC 遺伝子の転写活性の測定: 各海水試料からmRNA を抽出し、一般的な逆転写プライマーを用い、逆転写PCR 法でcDNA を作った。その後a.と同様に、定量PCR 法により遺伝子のコピー数を測定し、それぞれのcDNA コピー数から、単位海水試料当たりの各遺伝子の転写活性を定量的に把握した。さらにcDNA とDNA のコピー数を比較することで転写率が高い場所の特定と環境因子との関係解析を行った。同時にureC の転写活性も測定することで、AOA が実際に尿素を利用している可能性について検討した。3.次世代シーケンス法によるメタゲノム解析: 北極海で得られた水深100 mと1000 mの試料から、それぞれのDNAを抽出、精製し、得られたDNAを断片化した。その後、DNAフラグメントに特定アダプターを付加し、サイズセレクションを行った。同じ長さのDNAフラグメントをPCRで増幅し、ライブラリーピュリフィケーションを行った後、Illumina社製Hi-Seq次世代シーケンサーでシーケンシングを行った。得られたメタゲノムデータについて初期解析を行い、その結果をこれまで定量PCR及びクローンライブラリー法で得られた結果と比較することで、北極海表層及び深層での微生物多様性を全面的に把握した。