ボツリヌス毒素複合体の宿主侵入機構に関する構造生物学的研究

前年度から引き続きマウス小腸組織免疫染色の条件検討を行った結果、凍結切片を用いた免疫染色により膜タンパク質Xを染色することができた。培養細胞の結果と一致して、上皮細胞に取り込まれたHAは膜タンパク質Xと共局在した。この結果から、膜タンパク質Xは、in vitroだけでなくin vivoでもHAの細胞内取り込みに関与することが示唆された。しかし現染色条件は、陽性コントロールとして試したマウス肝臓組織切片では膜タンパク質X特異的な綺麗な染色像を示したが、マウス小腸組織切片では膜タンパク質Xに加えて非特異的染色が散見されるため、染色条件の改良やノックアウトマウスを用いた確認が必須である。CRISPR/Cas9システムを用いた膜タンパク質X欠損Caco-2細胞の作製では、数種のリポフェクション試薬を検討したが、どれもCaco-2細胞に対する遺伝子導入効率が低かったためまだ欠損細胞を作製できていない。再度条件検討を行った結果、エレクトロポレーション法を用いることでCaco-2細胞でも約80%の割合でGFP陽性細胞を得ることができた。現在、エレクトロポレーション法により欠損細胞の作製を行っている。ヒト大腸がん由来細胞株Caco-2細胞を用いてライセートを作製し、プルダウン法でHAと膜タンパク質Xの結合を解析した。前年度に実施したマウス小腸組織ライセートからプルダウンを行った結果と一致して、細胞ライセートから膜タンパク質XはHA特異的に共沈殿した。これまでに報告されているガラクトース、シアル酸又はE-カドヘリンに結合しないHAの各種変異体を用いて細胞ライセートからプルダウンを行った結果、ガラクトースに結合しない変異によって膜タンパク質Xはほとんど共沈殿しなくなった。これらの結果から、HAはヒト膜タンパク質Xと糖鎖依存的に相互作用をすることが明らかになった。

前年度から引き続きマウス小腸組織免疫染色の条件検討を行った結果、凍結切片を用いた免疫染色により膜タンパク質Xを染色することができた。培養細胞の結果と一致して、上皮細胞に取り込まれたHAは膜タンパク質Xと共局在した。この結果から、膜タンパク質Xは、in vitroだけでなくin vivoでもHAの細胞内取り込みに関与することが示唆された。しかし現染色条件は、陽性コントロールとして試したマウス肝臓組織切片では膜タンパク質X特異的な綺麗な染色像を示したが、マウス小腸組織切片では膜タンパク質Xに加えて非特異的染色が散見されるため、染色条件の改良やノックアウトマウスを用いた確認が必須である。CRISPR/Cas9システムを用いた膜タンパク質X欠損Caco-2細胞の作製では、数種のリポフェクション試薬を検討したが、どれもCaco-2細胞に対する遺伝子導入効率が低かったためまだ欠損細胞を作製できていない。再度条件検討を行った結果、エレクトロポレーション法を用いることでCaco-2細胞でも約80%の割合でGFP陽性細胞を得ることができた。現在、エレクトロポレーション法により欠損細胞の作製を行っている。ヒト大腸がん由来細胞株Caco-2細胞を用いてライセートを作製し、プルダウン法でHAと膜タンパク質Xの結合を解析した。前年度に実施したマウス小腸組織ライセートからプルダウンを行った結果と一致して、細胞ライセートから膜タンパク質XはHA特異的に共沈殿した。これまでに報告されているガラクトース、シアル酸又はE-カドヘリンに結合しないHAの各種変異体を用いて細胞ライセートからプルダウンを行った結果、ガラクトースに結合しない変異によって膜タンパク質Xはほとんど共沈殿しなくなった。これらの結果から、HAはヒト膜タンパク質Xと糖鎖依存的に相互作用をすることが明らかになった。