翻訳開始及びリボソーム成熟化におけるＩＦ５Ｂ－ストークタンパク質複合体の機能解析

IF5B-茎蛋白复合物在翻译起始和核糖体成熟中的功能分析

基本信息

批准号：
15J04972
负责人：
村上僚
金额：
$ 1.39万
依托单位：
The University of Tokyo (2016)Niigata University (2015)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J04972/
关键词：
タンパク質合成リボソーム翻訳開始

项目摘要

平成28年度は、前年度に引き続き、翻訳開始因子IF5Bによる翻訳開始反応およびリボソーム成熟化におけるリボソームストークタンパク質の機能的意義の解明を目指した。研究代表者は、出芽酵母eIF5Bを調製し、真核生物ストークタンパク質特異的抗体を利用したGTPase活性阻害実験を行った。その結果、ストーク抗体を実験系に加えた場合において、eIF5BのGTPase活性が低下した。この事から、真核生物のeIF5BのGTPase活性発現にはストークタンパク質が必要であることが示唆された。また、出芽酵母を用いたポリソームプロファイリングを行い、タンパク質合成を行っているリボソームが含まれるポリソーム画分の割合を検証した。リボソームストークタンパク質P1/P2遺伝子を部分的に欠損した酵母を用いて解析を行った所、野生型酵母に比べ、ポリソームの量が50%以下にまで低下したが、この表現型はeIF5Bの過剰発現によって回復された。また、ストーク欠損酵母株において、80Sリボソームに対する40S, 60Sサブユニットの割合が増加しており、80Sを正常に形成できないリボソームサブユニットが蓄積していた。さらにストーク欠損酵母株を用いてLacZレポーターを利用した翻訳開始の正確性の解析を行った所、ストーク欠損酵母株では翻訳開始の正確性が低下しており、この表現型は、野生型のeIF5Bの過剰発現で補完されたが、ストーク結合部位に変異を導入したeIF5Bの過剰発現では補完されなかった。以上の結果から、リボソームストークとeIF5Bの相互作用は、eIF5Bのリボソーム依存的なGTP加水分解活性に寄与しており、正常な80Sリボソームの形成、翻訳開始の厳密性と促進に必要であることを分子・細胞レベルで明らかにした。現在、以上の結果を前年度の結果と合わせ、国際論文として投稿中であり、査読に対応している段階である。

在2016年，与上一年一样，我们旨在阐明核糖体Stoke蛋白在翻译起始响应和核糖体成熟中的功能意义，而翻译起始因子IF5B。研究人员使用真核Stoke Stoke蛋白特异性抗体制备了芽酵母EIF5B并进行了GTPase活性抑制实验。结果，当将Stoke抗体添加到实验系统中时，会降低EIF5B的GTPase活性。这表明在真核EIF5B中GTPase活性表达需要Stoke蛋白。此外，使用发芽酵母进行多元组分析，以验证含有正在经历蛋白质合成的核糖体的多核体馏分的比例。使用在核糖体Stoke蛋白P1/P2基因中部分缺乏的酵母进行分析，尽管与野生型酵母相比，多聚糖体量降至小于50％，但通过EIF5B的过表达恢复了这种表型。此外，在缺陷型酵母菌菌株中，40s和60s亚基与80S核糖体的比例增加了，核糖体亚基通常无法形成80s。 Furthermore, when we analyzed the accuracy of translation initiation using LacZ reporter using Stoke-deficient yeast strains, the accuracy of translation initiation was reduced in Stoke-deficient yeast strains, and this phenotype was complemented by overexpression of wild-type eIF5B, but not by overexpression of eIF5B, which introduced a mutation at the Stoke-binding site.从这些结果中，在分子和细胞水平上揭示了核糖体Stoke和EIF5B之间的相互作用有助于EIF5B的核糖体依赖性GTP水解活性，并且对于正常80年代的核糖体形成和翻译起始的严格性和促进是必不可少的。目前，目前正在将上述结果作为国际论文提交，并将其与上一年的结果相结合，目前正在同行审查中。