体内時計の時刻合わせに関わる時計タンパク質のリン酸化状態の変化と調節化合物の探索

今年度は、１）CK2によってリン酸化される時計タンパク質の探索と２）ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いた老化と概日リズムとの関係についてさらに詳細な研究を行った。１）CK2によってリン酸化される時計タンパク質の探索ヒト胎児腎臓細胞HEK293TにFLAGタグ付きのマウスPer1, Per2, Cry1, Bmal1, ClockとHAタグ付きヒトのCK2α遺伝子をトランスフェクションによって導入した。得られた細胞抽出液をCK2によるリン酸化基質抗体を用いたウェスタンブロットによって調べた結果、PER1, PER2, CLOCKとほぼ同じ分子量にバンドが検出された。導入する時計遺伝子を１種類ずつ減らす実験を行った結果、PERがない条件の場合にのみCLOCKのリン酸化バンドが消失することが分かった。PERの存在がCLOCKのリン酸化に影響を及ぼすと考えられた。次にCK2が時計タンパク質と結合する条件を調べた。その結果、PERが存在しない場合、CK2が顕著に減少することが分かった。すなわち、CK2はCLOCKに近づくことができないためリン酸化が減少すると推測された。２）ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いた老化と概日リズムとの関係について前年度に引き続き、HUVECを用いて老化と概日リズムとの関係を調べた。HUVECをコンフルエントになるまで培養し、フォルスコリンで同調させ12時間後から4時間おきにサンプリングした。タンパク質抽出後、ウェスタンブロットにより、リン酸化の概日的な変化の有無を検証した。その結果、リン酸化される基質の中に概日的な変化をしているものがいくつか見られた。概日変化の差が大きい２つの時刻、同調後20時間目と32時間目について二次元電気泳動、続いてウェスタンブロット解析を行ったところ、Akt、AMPK、CDKによるリン酸化が大きく変化していることがわかった。

今年度は、１）CK2によってリン酸化される時計タンパク質の探索と２）ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いた老化と概日リズムとの関係についてさらに詳細な研究を行った。１）CK2によってリン酸化される時計タンパク質の探索ヒト胎児腎臓細胞HEK293TにFLAGタグ付きのマウスPer1, Per2, Cry1, Bmal1, ClockとHAタグ付きヒトのCK2α遺伝子をトランスフェクションによって導入した。得られた細胞抽出液をCK2によるリン酸化基質抗体を用いたウェスタンブロットによって調べた結果、PER1, PER2, CLOCKとほぼ同じ分子量にバンドが検出された。導入する時計遺伝子を１種類ずつ減らす実験を行った結果、PERがない条件の場合にのみCLOCKのリン酸化バンドが消失することが分かった。PERの存在がCLOCKのリン酸化に影響を及ぼすと考えられた。次にCK2が時計タンパク質と結合する条件を調べた。その結果、PERが存在しない場合、CK2が顕著に減少することが分かった。すなわち、CK2はCLOCKに近づくことができないためリン酸化が減少すると推測された。２）ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVECを用いた老化と概日リズムとの関係について前年度に引き続き、HUVECを用いて老化と概日リズムとの関係を調べた。HUVECをコンフルエントになるまで培養し、フォルスコリンで同調させ12時間後から4時間おきにサンプリングした。タンパク質抽出後、ウェスタンブロットにより、リン酸化の概日的な変化の有無を検証した。その結果、リン酸化される基質の中に概日的な変化をしているものがいくつか見られた。概日変化の差が大きい２つの時刻、同調後20時間目と32時間目について二次元電気泳動、続いてウェスタンブロット解析を行ったところ、Akt、AMPK、CDKによるリン酸化が大きく変化していることがわかった。