運動とカロリー制限による骨格筋ミトコンドリアの品質管理

３年度においては、選択的ミトコンドリア分解（マイトファジー）の定量法を確立するため、マウス骨格筋から抽出したミトコンドリア分画を用いてProteinase K protection assayの条件検討を行った。骨格筋細胞内にはマイトファジーを誘導するミトコンドリアに局在したそれらのタンパクのみならず、システムに関与しないサイトゾル中のタンパクも含有される。そこで、マイトファジーの進行に係るマイトファジー関連タンパク（Parkin）のみを定量するため、ミトコンドリアを抽出した後、その分画中に残存するサイトゾルのParkinをProteinaseで分解し、マイトファゴソーム内のParkinの定量を試みた。まず、マイトファジーの進行を遮断するためにコルヒチンを腹腔内投与したマウスの骨格筋を摘出後、抽出したミトコンドリア分画に対してProteinase K protection assayを行い、Western blot法にてミトコンドリアタンパク（COX IV）を定量した。その結果、ミトコンドリア分画中のミトコンドリアは酵素処理による分解を受けないことを確認した。次に、サイトゾルのParkinが酵素処理によって分解される条件を見出すため、ミトコンドリア分画とミトコンドリア抽出過程で発生するサイトゾル分画に対して酵素処理を行った。しかし、当初のProteinase K protection assayで設定した条件（酵素濃度、処理時間・温度）ではサイトゾル分画のParkinが分解される間に、ミトコンドリア分画のParkinが先に分解されてしまった。そこで、処理条件を複数設定してサイトゾル分画のみのParkinを分解することを試みたが、サイトゾル分画のParkinのみを分解できる条件を期間内に見出すことができず、方法の確立に至ることができなかった。

３年度においては、選択的ミトコンドリア分解（マイトファジー）の定量法を確立するため、マウス骨格筋から抽出したミトコンドリア分画を用いてProteinase K protection assayの条件検討を行った。骨格筋細胞内にはマイトファジーを誘導するミトコンドリアに局在したそれらのタンパクのみならず、システムに関与しないサイトゾル中のタンパクも含有される。そこで、マイトファジーの進行に係るマイトファジー関連タンパク（Parkin）のみを定量するため、ミトコンドリアを抽出した後、その分画中に残存するサイトゾルのParkinをProteinaseで分解し、マイトファゴソーム内のParkinの定量を試みた。まず、マイトファジーの進行を遮断するためにコルヒチンを腹腔内投与したマウスの骨格筋を摘出後、抽出したミトコンドリア分画に対してProteinase K protection assayを行い、Western blot法にてミトコンドリアタンパク（COX IV）を定量した。その結果、ミトコンドリア分画中のミトコンドリアは酵素処理による分解を受けないことを確認した。次に、サイトゾルのParkinが酵素処理によって分解される条件を見出すため、ミトコンドリア分画とミトコンドリア抽出過程で発生するサイトゾル分画に対して酵素処理を行った。しかし、当初のProteinase K protection assayで設定した条件（酵素濃度、処理時間・温度）ではサイトゾル分画のParkinが分解される間に、ミトコンドリア分画のParkinが先に分解されてしまった。そこで、処理条件を複数設定してサイトゾル分画のみのParkinを分解することを試みたが、サイトゾル分画のParkinのみを分解できる条件を期間内に見出すことができず、方法の確立に至ることができなかった。