軟骨細胞におけるＩｈｈの発現制御機構の解明

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本年度は、CRISPR/Cas9を用いて作出した領域Aを欠失したマウスを用いて、胎生期における領域AのIhh遺伝子発現への寄与を検証した。まず、E18.5の胎仔を用いて、whole mount skeletal double stainingと脛骨近位の骨組織に対するヘマトキシリン・エオシン染色とvon Kossa染色を行った。その結果、領域Aのホモ欠失マウスではIhhノックアウトマウスで認められる骨殻の形成不全、成長板における軟骨細胞の分化過程の異常は認められなかった。次に、Ihh遺伝子の発現量を野生型マウスと領域Aのホモ欠失マウスのE18.5胎仔間で比較したところ、領域Aのホモ欠失マウスでは野生型に比べて5％程度のコピー数の減少を認めるのみで統計学的有意差を認めなかった。以上の結果より、胎生期における領域A単独の欠失がIhh遺伝子発現へ与える影響はわずかであり、Ihhの発現制御においては、複数のエンハンサーによって各々の機能を補完しあうエンハンサーネットワークが存在することが示唆された。領域Aにおけるエンハンサー活性の制御機構に関する検討では、今回新たにマウス新生仔肋軟骨細胞におけるSox6のChIPシークエンスを行い、得られたデータを解析した。その結果、Sox6は軟骨細胞において遠位エンハンサーのSoxモノマーモチーフを介して軟骨形成に関与する遺伝子群の転写制御に関与している可能性が示唆された。さらに領域AでSox6のピークを認めたことから、Sox6とSox9は共に領域Aに作用することが示唆された。これまでの、一連のゲノムワイドな解析により得られた結果は、領域Aの活性制御にSox trioが関与している可能性を支持するものであった。