膜タンパク質インタフェースによるｉＰＳ細胞由来神経細胞の機能評価手法の構築

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計画2年目は，初年度の技術を基に研究した．インタフェースには脂質二重膜および膜タンパク質Connexin43 (CX43)が必要であり，神経細胞の評価には特性計測が重要である．1) 脂質二重膜の形成手法　平滑基板では，膜タンパク質の構造異常が示唆されていた．そこで，多孔質支持型の二重膜形成を目指した．素材として，アガロースと貫通孔を有するメンブレンフィルタを用いた．自発展開法で二重膜を展開させ，展開速度の変化を記録した．結果，アガロース，親水化ガラス，メンブレンフィルタの順に速度が大きかった．親水度は，親水化ガラス，メンブレンフィルタ，アガロースの順であった．通常，親水度と速度は相関するため，ハイドロゲルでの速度が速いことが示唆された．低親水性の基板では，一重膜が展開するため，同様であった可能性がある．以上から，メンブレンフィルタ上での二重膜の形成が示された．十分な安定性と膜タンパク質の機能性が両立できることを意味する点で重要である．2) CX43の合成　人工細胞膜と細胞の間に貫通孔を形成するため，ギャップ結合に関わる膜タンパク質CX43に注目した．無細胞合成システムによりCX43を合成できることを確認した．CX43 DNAに，PCRで必要な配列を付加した．シーケンサで配列を確認し，タンパク質合成試薬で合成した．ウェスタンブロット法で，抗体を用いて検出した．結果，CX43が検出された．以上より，目的としたタンパク質の合成に成功したことが示された．3)マイクロデバイス開発　神経細胞の成熟に伴う変化を検出するためにデバイスを作製した．軸索から活動を検出する構造とし，伝導速度から神経細胞の成熟度合いを評価した．結果，培養日数の経過に伴い，伝導速度が上昇した．これは，従来神経細胞の活動タイミングのみしか計測できなかった計測系に，あらたな計測対象を提供したという点で意義がある．