構造‐機能連関に基づいた新たな光遺伝学ツールのデザイン

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本研究では微生物型ロドプシンの機能を電気生理学・分光学的に解析し、光感受性タンパク質の構造‐機能連関に基づいて、1.光に対しての高感度の微生物型ロドプシン改変体の作製や、2.イオン選択性の高い光感受性タンパク質をデザインし、それらを用いて生命現象をコントロールすることを目的としている。初年度よりwhole cell patch clamp法を用いて、光駆動プロトンポンプであるKR2(Inoue et al., 2013)の電気生理学的な解析を行った。2018年度は2波長の同時照射やレーザー光を用いた実験を組み合わせ、KR2の中間体の動態がイオンの組成や膜電位によって異なることを明らかにした。以上の結果について、現在、論文投稿中である。またイオン選択性の高いチャネル改変体作製のための鋳型となるチャネルロドプシンの選定を行った。オプトジェネティクスで広く使用されているチャネルロドプシン2(ChR2) は、陽イオン非選択的なチャネルであり、Na+よりもH+の輸送比率も高い。クリプト藻由来のGtCCR4(Yamauchi et al., 2017) について、電気生理学的手法を用いて解析したところ、ChR2に比べてNa+選択性が高いことが判明した。2018年度はGtCCR4のイオン輸送経路の同定と、クリプト藻が持つ4つの陽イオンチャネル(GtCCR1, GtCCR2, GtCCR3, GtCCR4)の物性を比較した。その結果、いくつかの変異体で光電流の減衰が見られ、ロドプシン内の酸性アミノ酸がイオン輸送に関与していることが示唆された。またGtCCR4がその他のクリプト藻由来の陽イオンチャネルよりも光感度が良いことが判明した。さらにこれら微生物型ロドプシンによる神経活動の制御が可能であることを、初代神経培養細胞を用いた実験で示した。