拡張ナノ空間を用いた単一・可算個分子ＥＬＩＳＡの開発

近年、バイオや医学では分析対象の超微量化や低濃度化が進んでいる。例えば、単一細胞分析では単一細胞体積(pL)かつ低濃度(pM)の条件で目的分子数は単一・可算個となる。しかし、これまで単一分子レベルの極限分析は困難であった。一方、当研究室では酵素免疫分析法(ELISA)を拡張ナノ空間（10^2 nm空間）へ集積した拡張ナノ流体デバイスを創成し、単一分子感度を実証してきた。しかし、単一分子の分析にはバックグランドとなる擬似信号が観測されるなど、単一分子の分析化学手法としては未確立であった。そこで、本研究は擬似信号の原因解明と除去による単一分子ELISAの確立を目的とした。擬似信号には主に以下の２つの原因を考えた。①従来のELISAで知られている酵素標識抗体の非特異吸着②その他の未知の要因28年度は、②として加工プロセスでの残留物質Crによる疑似酵素反応が要因であることを解明し、新規加工プロセスによりCrの影響をゼロにした。そこで、29年度は①の低減に取り組んだ。特に比界面積が大きくなる拡張ナノ空間では非特異吸着を抑制するブロッキング条件の確立が不可欠である。ブロッキング剤としてよく用いられるBSAを用い、擬似信号がゼロとなる条件を探索した。その結果、アッセイ前ブロッキング条件として2%BSA + 0.05%Tween20、アッセイ中ブロッキング条件として1%BSAで非特異吸着がゼロになり、かつ単一分子の信号も得られることを見出した。アッセイ前ブロッキング条件についてはマイクロELISAの条件（1％BSA）よりも濃度が高く、さらにTween20により密にBSAを被覆する必要性も明らかにした。すなわち、マイクロ・拡張ナノ空間の比界面積の差がブロッキング条件に大きく影響していることを明らかにした。また、この条件を用いて、単一・可算個分子領域での検量線をはじめて取得することに成功した。

近年、バイオや医学では分析対象の超微量化や低濃度化が進んでいる。例えば、単一細胞分析では単一細胞体積(pL)かつ低濃度(pM)の条件で目的分子数は単一・可算個となる。しかし、これまで単一分子レベルの極限分析は困難であった。一方、当研究室では酵素免疫分析法(ELISA)を拡張ナノ空間（10^2 nm空間）へ集積した拡張ナノ流体デバイスを創成し、単一分子感度を実証してきた。しかし、単一分子の分析にはバックグランドとなる擬似信号が観測されるなど、単一分子の分析化学手法としては未確立であった。そこで、本研究は擬似信号の原因解明と除去による単一分子ELISAの確立を目的とした。擬似信号には主に以下の２つの原因を考えた。①従来のELISAで知られている酵素標識抗体の非特異吸着②その他の未知の要因28年度は、②として加工プロセスでの残留物質Crによる疑似酵素反応が要因であることを解明し、新規加工プロセスによりCrの影響をゼロにした。そこで、29年度は①の低減に取り組んだ。特に比界面積が大きくなる拡張ナノ空間では非特異吸着を抑制するブロッキング条件の確立が不可欠である。ブロッキング剤としてよく用いられるBSAを用い、擬似信号がゼロとなる条件を探索した。その結果、アッセイ前ブロッキング条件として2%BSA + 0.05%Tween20、アッセイ中ブロッキング条件として1%BSAで非特異吸着がゼロになり、かつ単一分子の信号も得られることを見出した。アッセイ前ブロッキング条件についてはマイクロELISAの条件（1％BSA）よりも濃度が高く、さらにTween20により密にBSAを被覆する必要性も明らかにした。すなわち、マイクロ・拡張ナノ空間の比界面積の差がブロッキング条件に大きく影響していることを明らかにした。また、この条件を用いて、単一・可算個分子領域での検量線をはじめて取得することに成功した。