ヒト乳腺オルガノイド培養を用いた細胞極性制御機構の解析と乳がん治療への応用

細胞極性の消失は多くのがん細胞で見られる特徴であり、その悪性度を判断する上でも重要な情報である。近年、繋留因子(Tethering factor)であるexocyst複合体が細胞極性因子Par3と結合し、正常乳腺細胞の生存性を決定するという報告が成された。しかし、哺乳類細胞におけるexocyst複合体の分子機構は不明な点が多く、より詳細な解析が求められていた。本研究では、CRISPR/Cas9を利用し、細胞極性制御因子であるexocystの5つのサブユニットにsfGFPが融合したexocyst-sfGFPノックイン細胞株を作成した。膜融合時の各exocystサブユニットの役割を調べるために、樹立した５つのノックイン細胞株を用いて、内在性exocyst subunitとvesicle fusion markerの時空間的発現様式を全反射照明顕微鏡(Total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM)により高速撮影した。その結果、マウス乳腺上皮細胞株において、exocyst複合体は２つのsubcomplexから構成されること、膜融合直前に解離すること、約９つのexocyst複合体が１回の膜融合に関わることなどが明らかになった。残りの３つのexocystサブユニットの細胞内局在を詳細に観察するために、Cas9-gRNA ribonucleoproteins (RNPs)を用いたノックイン細胞の作成を進めている。

細胞極性の消失は多くのがん細胞で見られる特徴であり、その悪性度を判断する上でも重要な情報である。近年、繋留因子(Tethering factor)であるexocyst複合体が細胞極性因子Par3と結合し、正常乳腺細胞の生存性を決定するという報告が成された。しかし、哺乳類細胞におけるexocyst複合体の分子機構は不明な点が多く、より詳細な解析が求められていた。本研究では、CRISPR/Cas9を利用し、細胞極性制御因子であるexocystの5つのサブユニットにsfGFPが融合したexocyst-sfGFPノックイン細胞株を作成した。膜融合時の各exocystサブユニットの役割を調べるために、樹立した５つのノックイン細胞株を用いて、内在性exocyst subunitとvesicle fusion markerの時空間的発現様式を全反射照明顕微鏡(Total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM)により高速撮影した。その結果、マウス乳腺上皮細胞株において、exocyst複合体は２つのsubcomplexから構成されること、膜融合直前に解離すること、約９つのexocyst複合体が１回の膜融合に関わることなどが明らかになった。残りの３つのexocystサブユニットの細胞内局在を詳細に観察するために、Cas9-gRNA ribonucleoproteins (RNPs)を用いたノックイン細胞の作成を進めている。