繰り返し型ポリケタイド合成酵素の機能解析とプログラミング制御の解明

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本年度は、生合成経路の不明なシクロペンテン骨格を有する天然物テレイン、パルメノンの生合成研究を行った。同時に、繰り返し型PKSを材料としたキメラ酵素の機能解析を行った。テレインとパルメノンの生合成遺伝子クラスターを精査したところ、各化合物に特有の生合成遺伝子を見出したため、機能解析を行った。その結果、テレイン生合成経路においては、機能が不明であったFMO遺伝子、パルメノン生合成においては化学的性質の異なる2か所を連続してクロロ化するフラビン依存ハロゲン化酵素の解析に成功した。並行して、ポリケタイド合成酵素-非リボソームペプチド合成酵素(PKS-NRPS)を材料としたキメラ酵素遺伝子の調製、並びにキメラ酵素の機能解析も行った。まず、酵素生成物を酵素から切り出すためのドメインについて、予想ドメイン間領域において複数のキメラ酵素遺伝子を作成し、麹菌において異種発現させたところ、非天然型の化合物の生産に成功した。以上から、麹菌が単なる異種発現宿主ではなく、機能を改変した酵素の解析に適していることを再確認できた。本結果をもとに研究を継続する上で、迅速なキメラ酵素遺伝子の構築方法が必要であったため、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9に着目した。麹菌の染色体上に、キメラ酵素遺伝子のベースをあらかじめ導入しておく。その形質転換体においてCas9タンパク質を発現させてベース遺伝子の任意の領域を切断し、相同組み換えで標的遺伝子を組み込んだキメラ酵素遺伝子をin vivoで構築した。本手法を用い、機能解析済みのPKS-NRPSの中から相同性が40～80％程度の組み合わせを計10種類作成し、麹菌を用いて機能解析を試みた。その結果、相同性を指標とした研究対象選定の基準が示唆された。