細菌のアラニン排出輸送体に関する構造と機能解析および発酵生産への応用の基盤研究

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本年度は、排出輸送体の機能強化によってL-アラニンの発酵生産効率を上げるためにはAlaEに関する構造の研究を行うことが重要であると考え、AlaEの結晶化を試みた。結晶化実験においてはまず、AlaEのN-末端またはC-末端に10×His-tagを付加したAlaE発現プラスミドを構築した。これを大腸菌において発現させた結果、C-末端にHis-tagを付加したものでは精製するために十分な量のAlaEの発現がみられた。このC-His_AlaEを大腸菌において発現させた後、破砕を行い、膜画分を回収した。その後、界面活性剤用いて可溶化実験を行った。しかし、一般的に可溶化に用いられる界面活性剤であるDDMやOGなどにはほとんどAlaEを可溶化することはできなかった。そこで、様々な界面活性剤でAlaEを可溶化できるものを探索した結果、ヘッドの部分の構造が小さい界面活性剤によってAlaEが可溶化できることが分かった。ヘッドの構造が小さい界面活性剤を用い可溶化を行い、その後Talon-resinを用い1次精製を行った。その結果、800 mgの膜タンパク質から約15mgのAlaEを精製することができた。このAlaEをFPLCを用いて2次精製を行ったところ、数mgのAlaEを獲得することができた。よって、精製後のAlaEと結晶化スクリーニングキットを用いてAlaEの結晶を獲得できないか試みた。その結果、1つの条件でAlaEの結晶を獲得することができた。この条件下においては、再現性のある結晶を獲得することに成功している。この結晶をｘ線で解析した結果、まだ低い分解能しか得ることはできなかった。現在この結晶化条件を基準とし、良質な分解能を持つ結晶を獲得するために沈殿剤の濃度やバッファーpHを変化させることや金属イオン、基質の添加など様々な条件を検討し構造解析可能なAlaEの結晶を獲得すること試みている。