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細菌のアラニン排出輸送体に関する構造と機能解析および発酵生産への応用の基盤研究

细菌丙氨酸外排转运蛋白结构和功能分析及其在发酵生产中的应用基础研究

基本信息

批准号：
17J03042
负责人：
勝部哲
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J03042/
关键词：
大腸菌 AlaE 結晶化 YtfF L-アラニン構成的

项目摘要

本年度は、排出輸送体の機能強化によってL-アラニンの発酵生産効率を上げるためにはAlaEに関する構造の研究を行うことが重要であると考え、AlaEの結晶化を試みた。結晶化実験においてはまず、AlaEのN-末端またはC-末端に10×His-tagを付加したAlaE発現プラスミドを構築した。これを大腸菌において発現させた結果、C-末端にHis-tagを付加したものでは精製するために十分な量のAlaEの発現がみられた。このC-His_AlaEを大腸菌において発現させた後、破砕を行い、膜画分を回収した。その後、界面活性剤用いて可溶化実験を行った。しかし、一般的に可溶化に用いられる界面活性剤であるDDMやOGなどにはほとんどAlaEを可溶化することはできなかった。そこで、様々な界面活性剤でAlaEを可溶化できるものを探索した結果、ヘッドの部分の構造が小さい界面活性剤によってAlaEが可溶化できることが分かった。ヘッドの構造が小さい界面活性剤を用い可溶化を行い、その後Talon-resinを用い1次精製を行った。その結果、800 mgの膜タンパク質から約15mgのAlaEを精製することができた。このAlaEをFPLCを用いて2次精製を行ったところ、数mgのAlaEを獲得することができた。よって、精製後のAlaEと結晶化スクリーニングキットを用いてAlaEの結晶を獲得できないか試みた。その結果、1つの条件でAlaEの結晶を獲得することができた。この条件下においては、再現性のある結晶を獲得することに成功している。この結晶をｘ線で解析した結果、まだ低い分解能しか得ることはできなかった。現在この結晶化条件を基準とし、良質な分解能を持つ結晶を獲得するために沈殿剤の濃度やバッファーpHを変化させることや金属イオン、基質の添加など様々な条件を検討し構造解析可能なAlaEの結晶を獲得すること試みている。

This year, the function enhancement of the discharge conveyor, the fermentation productivity of the L-chain, and the research on the structure of AlaE are important. Crystallization of AlaE was carried out by adding 10×His-tag to the N-terminal and C-terminal of AlaE. The result of this is that the C-terminal His-tag is added to the AlaE. The C-His_AlaE was found in the middle of the day, and the membrane was recovered. After that, the interface active agent is dissolved in the solvent. For general solubility, the surfactant is DDM and AlaE. The structure of the interface active agent is small, and the solubility of AlaE is high. For example, the structure of the interface active agent can be dissolved in the solution, and the Talon-resin can be refined in the solution. As a result, 800 mg of the film was purified from about 15mg of AlaE. AlaE is used twice to refine the product. After purification, crystallization of AlaE can be obtained. The result is that AlaE is crystallized under the condition of 1. Under these conditions, we can achieve success in achieving reproducibility and crystallization. The crystal X-ray analysis results in low resolution energy. Now the crystallization conditions are baseline, good quality, decomposition energy, crystallization, precipitation, concentration, pH, metal, matrix addition, crystallization conditions, structural analysis, crystallization of AlaE.