エピゲノム編集による脂肪細胞分化制御

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本研究は、CRISPR-dCas9システムを基盤とするSunTag法を利用してヒストン修飾の人工的書き換えによる脂肪細胞分化制御を目指すものであり、ヒストンメチル化酵素の特定遺伝子領域へのリクルートメントに挑むものである。SunTag法を用いて脂肪細胞分化制御遺伝子の領域に複数のヒストン修飾酵素をリクルートすることで人工的に脂肪細胞分化を調節できる可能性を考慮し、昨年度より開始した発現ベクター作製に継続して取り組んだ。本研究に用いるSunTag法では、（１）guide RNA(gRNA)発現プラスミド、（２）不活性化Cas9 (dCas９)とGCN4の発現プラスミド、（３）ヒストン修飾酵素およびGCN4認識抗体の発現プラスミドの３種が必要となる。（３）の発現プラスミドの作製にあっては、ヒト型SETDB1の活性ドメイン（a.a. 570 - 1291）を含む配列、もしくは単純ヘルペスウイルス由来の転写活性化ドメインVP16 の 4 量体 VP64 の配列を導入した。これらのプラスミド作製においては、脂肪細胞分化過程における安定発現を可能とするため、レトロウィルス発現プラスミド骨格を使用した。作製したプラスミドは、PEIトランスフェクション法をもちいてPlatE細胞に遺伝子導入し、レトロウィルスを作製した。（１）、（２）、もしくは（３）のレトロウィルスを段階的に3T3-L1細胞に感染させたのち、各段階で抗生物質スクリーニングを実施して繰り返し、すべての要素を発現する安定発現細胞株を得ることに成功した。