Elucidation of mechanism of pollen tube guidance via single-molecule imaging

本研究の最終年度では、これまでの研究で開発したマイクロ流体インジェクターに花粉管の培養チャンバーを組み合わせたデバイスを作製した。実験に使用したシロイヌナズナの花粉管が伸長する長さは0.5ミリ程度であり、これまでに報告されていたマイクロ流体デバイスでは、シロイヌナズナの花粉管をデバイス外からデバイス内に誘導することは困難であった。この問題を解決する為に、花粉管の培養チャンバーを親水化することでチャンバー内の培養液の高さを薄くし、花柱の切り口から出てきた花粉管がすぐに流路へ入れるような工夫することで、再現性良く花粉管をデバイス内に入れることができた。また、開発したデバイスを用いて、インジェクションした蛍光分子の1分子イメージングを行った。インジェクションした蛍光分子の数を定量解析するために、３０マイクロメートル四方のチャンバーをデバイス内に用意し、その中に入った分子の蛍光画像を全反射顕微鏡を用いて取得した。チャンバーの底部分はガラスになっており、ガラス表面に局所的な化学的な修飾を施すことで、蛍光分子がガラス表面に吸着するようにした。その結果、インジェクションを行った直後から１分子の蛍光ピークが観察された。検出された蛍光ピークの数を定量解析した結果、インジェクションの時間を上げるにつれて、１分子の蛍光ピークの数も増えていくことが確認された。この結果から、今回開発したインジェクターデバイスを用いることで、伸長する花粉管の先端部位に数分子程度の花粉管誘引分子を与えるための技術基盤を確立することができた。

本研究の最終年度では、これまでの研究で開発したマイクロ流体インジェクターに花粉管の培養チャンバーを組み合わせたデバイスを作製した。実験に使用したシロイヌナズナの花粉管が伸長する長さは0.5ミリ程度であり、これまでに報告されていたマイクロ流体デバイスでは、シロイヌナズナの花粉管をデバイス外からデバイス内に誘導することは困難であった。この問題を解決する為に、花粉管の培養チャンバーを親水化することでチャンバー内の培養液の高さを薄くし、花柱の切り口から出てきた花粉管がすぐに流路へ入れるような工夫することで、再現性良く花粉管をデバイス内に入れることができた。また、開発したデバイスを用いて、インジェクションした蛍光分子の1分子イメージングを行った。インジェクションした蛍光分子の数を定量解析するために、３０マイクロメートル四方のチャンバーをデバイス内に用意し、その中に入った分子の蛍光画像を全反射顕微鏡を用いて取得した。チャンバーの底部分はガラスになっており、ガラス表面に局所的な化学的な修飾を施すことで、蛍光分子がガラス表面に吸着するようにした。その結果、インジェクションを行った直後から１分子の蛍光ピークが観察された。検出された蛍光ピークの数を定量解析した結果、インジェクションの時間を上げるにつれて、１分子の蛍光ピークの数も増えていくことが確認された。この結果から、今回開発したインジェクターデバイスを用いることで、伸長する花粉管の先端部位に数分子程度の花粉管誘引分子を与えるための技術基盤を確立することができた。