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褐藻のバイオエタノール変換を目指した酵母共培養プラットフォームの構築

褐藻生物乙醇转化酵母共培养平台的构建

基本信息

批准号：
18J10103
负责人：
佐々木勇輔
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度では、その適応進化をゲノミクスの視点から解析した。本年度は、その解析結果に基づき、in vitro およびin vivoにおけるreverse engineeringを実施し、同定した遺伝子変化を評価した。適応進化株の全ゲノム比較解析により、アルギン酸代謝に関わるDehRレダクターゼにおいて、非同義変異（T16K）を同定した。その変異型酵素の活性を野生型と比較評価するため、それぞれ大腸菌（BL21）で生産後、His-tag精製を行った。精製酵素を用いて、補酵素NAD(P)Hに対するKmとKcatを算出した。その結果、変異型DehRでは、NADH/NADPH比率が0.89と野生型の21.8%になっていることがわかった。NADHに対するKcatは、変異型で1.1倍の増加に対して、NADPHに対するKcatは、1.6倍の増加であることより、T16Kの変異は、DehRのNADPHに対する酵素活性を特に向上させたと考えられる。T16Kが酵素活性向上にどのように寄与しているのか、解明するため、野生型・変異型DehRのタンパク質モデルを作成し、補酵素をbinding siteへドッキングさせたシミュレーションを実施した。その結果、T16部位は、ループ構造を形成して補因子と結合し、酸素と相互作用する箇所であることがわかった。16K変異は、そのプール構造と隣接するヘリックスとの空間を拡張する。その空間によって、変異型ではNADPがより許容され、酵素活性の向上につながったと考えられる。

Previous year's では, そのAdaptation Evolution をゲノミクスのViewpoint からANALYSIS した. This year's は、そのanalytical resultsにbasedづき、in vitroおよびin vivoにおけるreverse engineeringを実时し、同定した缝子変化を综合価した. Comparative analysis of Adaptive Evolutionary Strain の全ゲノム, アルギンAcid Metabolism に关わるDehR レダクターゼにおいて, non-synonymous difference (T16K) を同定した. Comparative evaluation of the active and wild-type enzymes of その変 isoenzymes and the production of それぞれ coliform (BL21) and His-tag purified products. Purified enzyme を uses いて, supplemented enzyme NAD(P)Hに対するKmとKcatをcalculates した. As a result, the abnormality of DehR and the NADH/NADPH ratio were 0.89 and 21.8% of the wild type, respectively. NADHに対するKcatは、変综合で1.1 timesのincrease plusに対して、NADPHに対するKcatは、1.6 times the increase Add であることより, T16K の変different は, DehR のNADPH に対するenzyme activity を特にUP させたとtest えられる. T16K Enzyme Activity Upward にどのように发与しているのか、clearly clear するため、wild type・変isotype DehRのタンパクquality モデルを成し、supplementary enzyme をbinding siteへドッキングさせたシミュレーションを実士した. The result, T16 site, structure, formation, complement factor, binding, acid element, interaction, etc. 16K different structures and adjacent structures.そのSpace によって, 変 Special type ではNADP がより Allowance され, Enzyme activity のUP につながったとtest えられる.