褐藻のバイオエタノール変換を目指した酵母共培養プラットフォームの構築

点击翻译按钮获取中文摘要

前年度では、その適応進化をゲノミクスの視点から解析した。本年度は、その解析結果に基づき、in vitro およびin vivoにおけるreverse engineeringを実施し、同定した遺伝子変化を評価した。適応進化株の全ゲノム比較解析により、アルギン酸代謝に関わるDehRレダクターゼにおいて、非同義変異（T16K）を同定した。その変異型酵素の活性を野生型と比較評価するため、それぞれ大腸菌（BL21）で生産後、His-tag精製を行った。精製酵素を用いて、補酵素NAD(P)Hに対するKmとKcatを算出した。その結果、変異型DehRでは、NADH/NADPH比率が0.89と野生型の21.8%になっていることがわかった。NADHに対するKcatは、変異型で1.1倍の増加に対して、NADPHに対するKcatは、1.6倍の増加であることより、T16Kの変異は、DehRのNADPHに対する酵素活性を特に向上させたと考えられる。T16Kが酵素活性向上にどのように寄与しているのか、解明するため、野生型・変異型DehRのタンパク質モデルを作成し、補酵素をbinding siteへドッキングさせたシミュレーションを実施した。その結果、T16部位は、ループ構造を形成して補因子と結合し、酸素と相互作用する箇所であることがわかった。16K変異は、そのプール構造と隣接するヘリックスとの空間を拡張する。その空間によって、変異型ではNADPがより許容され、酵素活性の向上につながったと考えられる。