構造多型の弁別を軸とした植物光受容蛋白質シグナルカスケードメカニズムの解析

以结构多态性判别为核心的植物感光蛋白信号级联机制分析

• 批准号: 18J11653
• 负责人: 大出 真央
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J11653/
• 关键词: 蛋白質動態解析; クライオ電子顕微鏡; 光受容蛋白質; X線小角散乱

申請者は前年度に実施したクライオ電子顕微鏡(cryoEM)を用いたグルタミン酸脱水素酵素(GDH)構造解析により、複数の準安定な構造を得ていた。本年度においては分子動力学(MD)計算による先行研究で得られていた構造を参照構造として用いることで、cryoEM観察像から各構造の生じうる確率を定量的に推定する新規解析手法を開発し、GDHドメイン運動の解析を行った。開発手法によって得られたGDHドメイン運動の自由エネルギー地形はMD計算で得られていた地形と異なるより複雑な地形であり、この地形からGDHの構造変化経路について実験データに基づく新たな知見が得られた。これら結果をまとめて査読付き国外学術誌に発表し、また、学会にて発表を行う予定である。また、本研究の目的蛋白質フォトトロピン(phot)と類縁のフィトクロムBについて(phyB)について、前年度のX線小角散乱実験で得られた知見を踏まえてcryoEM試料作製条件の詳細な検討を行った。まず、phyBは不活性な赤色光吸収型(Pr)では単分散であるが、活性のある赤外光吸収型(Pfr)において非特異的な凝集を生じる。cryoEM観察では孤立粒子像を解析に用いるため、蛋白質精製から凍結試料作成に至るまで暗条件下かつ定期的な赤外光照射によるPr型への変換を実施することで凝集の少ないcryoEM撮影に成功した。また、初期に行ったcryoEM観察では解析で得られた平均二次元投影像は詳細な構造の見えない不明瞭なものであった。申請者はこの原因をphyB分子の気液界面との接触による構造破壊であると推測し、cryoEM観察試料作製の前処理として化学固定を行った。その結果、二次元投映像の分解能は大きく向上し、蛋白質二次構造とみられる特徴的な形状パターンが確認できた。phyBで検討した試料作成方法はphot2においてもその効果が期待されるものである。

In the past year, the applicant has implemented the analysis of acid dehydrin enzyme (GDH) structure and obtained a plurality of quasi-stable structures using cryoEM. This year, molecular dynamics (MD) calculations were conducted in advance to obtain structural reference structures, to use cryoEM images, to quantitatively estimate the accuracy of structural generation, to develop new analytical methods, and to analyze GDH motion. The development method is to obtain the free generation of GDH motion and the terrain is to obtain the MD calculation. The terrain is different from the terrain. The terrain is to obtain the GDH structural transformation. The basic knowledge is to obtain the MD calculation. The results of this research are expected to be published in foreign academic journals. The target protein of this study was identified as phot, phyB, and X-ray scattering in the previous year. Detailed investigation of the preparation conditions of cryoEM samples was carried out. Pfr, Pfr CryoEM detection of isolated particle image analysis, protein purification, frozen sample preparation, to dark conditions, periodic red light irradiation, Pr type conversion, and aggregation of small amounts of cryoEM image successfully In the early stages of the process, the average two-dimensional projection image was analyzed. The structure was unknown. The applicant is responsible for the preparation and chemical fixation of phyB molecules at the interface between gas and liquid. The results show that the decomposition energy of the quadratic projection image is large and upward, and the shape of the protein secondary structure is confirmed. phyB test sample preparation method is phot2.

项目成果

Structural analysis of Arabidopsis phytochrome B by small-angle X-ray scattering coupled with size-exclusion chromatography

小角 X 射线散射结合尺寸排阻色谱法对拟南芥光敏色素 B 进行结构分析

• 发表时间: 2019
• 作者: Mao Oide;Yuki Sekiguchi;Asahi Fukuda;Koji Okajima;Tomotaka Oroguchi;Masayoshi Nakasako;大出 真央;大出 真央;大出 真央
• 通讯作者: 大出 真央

クライオ電子顕微鏡を用いたグルタミン酸脱水素酵素ドメイン運動の解析

使用冷冻电子显微镜分析谷氨酸脱氢酶结构域运动

• 发表时间: 2018
• 作者: Mao Oide;Yuki Sekiguchi;Asahi Fukuda;Koji Okajima;Tomotaka Oroguchi;Masayoshi Nakasako;大出 真央;大出 真央;大出 真央;大出真央;大出真央
• 通讯作者: 大出真央

Energy landscape of domain motion in glutamate dehydrogenase deduced from cryo‐electron microscopy

• DOI: 10.1111/febs.15224
• 发表时间: 2020-01
• 期刊: The FEBS Journal
• 作者: Mao Oide;Takayuki Kato;Tomotaka Oroguchi;M. Nakasako

SEC-SAXS法によるシロイヌナズナ由来フィトクロムBの構造解析

SEC-SAXS 法分析拟南芥光敏色素 B 的结构

• 发表时间: 2020
• 作者: Mao Oide;Yuki Sekiguchi;Asahi Fukuda;Koji Okajima;Tomotaka Oroguchi;Masayoshi Nakasako;大出 真央
• 通讯作者: 大出 真央

Visualizing the domain motion of Glutamate Dehydrogenase by using cryo-electron microscopy

使用冷冻电子显微镜可视化谷氨酸脱氢酶的结构域运动

• 发表时间: 2018
• 作者: Mao Oide;Yuki Sekiguchi;Asahi Fukuda;Koji Okajima;Tomotaka Oroguchi;Masayoshi Nakasako;大出 真央;大出 真央;大出 真央;大出真央;大出真央;大出真央
• 通讯作者: 大出真央