タンパク質の膜挿入・膜透過経路の再構成による糖脂質ＭＰＩａｓｅの作用機構の解明

R2年度では、2年目で確立したTat因子およびMPIaseの精製法、プロトン駆動力の形成条件により、各因子の精製と再構成系の構築を行った。プロテオリポソーム存在下でTAT基質SufIをRIラベル合成し、プロテオリポソームに対する膜透過を観察したところ、TatABC/MPIase全てを含むプロテオリポソーム存在下でのみSufIの膜透過が観察された。またMPIase量を増加させたところ、SufIの膜透過活性はさらに上昇した。これらの結果は、報告されていた必須因子TatABCおよびプロトン駆動力だけではなく、糖脂質MPIaseもTAT膜透過反応に必須であることを強く示したものである。精製因子のみによるTAT膜透過反応の再構成系において活性が確認されたのは、本研究が世界で初めてである。またTAT膜透過反応においてMPIaseは基質の膜へのターゲティングに関与しているというデータも得られた。基質のシグナル配列を認識すると従来報告されてきたTatCを欠損させた株を用い、細胞質に蓄積するであろう前駆体SufIの精製を試みたが、TatC欠損株でもSufIは細胞質膜上に局在していた。一方MPIase枯渇株では、前駆体SufIは細胞質膜上には局在せず、細胞質に蓄積していた。この結果は、TatCではなくMPIaseが基質の膜ターゲティングに関与していることを示唆している。さらに、膜透過が阻害されるシグナル配列の変異体であるSufI (KK) でもMPIaseが存在する内膜への局在が観察された。一連の結果から、MPIaseは細胞質膜上でTAT基質前駆体を受容するが、そのシグナル配列が機能的であるかどうかを識別することはできず、MPIaseによって膜挿入された基質シグナル配列のRR残基をTatCが認識することでTAT膜透過反応がスタートするという新たな膜透過モデルを提唱できる。

R2年度では、2年目で確立したTat因子およびMPIaseの精製法、プロトン駆動力の形成条件により、各因子の精製と再構成系の構築を行った。プロテオリポソーム存在下でTAT基質SufIをRIラベル合成し、プロテオリポソームに対する膜透過を観察したところ、TatABC/MPIase全てを含むプロテオリポソーム存在下でのみSufIの膜透過が観察された。またMPIase量を増加させたところ、SufIの膜透過活性はさらに上昇した。これらの結果は、報告されていた必須因子TatABCおよびプロトン駆動力だけではなく、糖脂質MPIaseもTAT膜透過反応に必須であることを強く示したものである。精製因子のみによるTAT膜透過反応の再構成系において活性が確認されたのは、本研究が世界で初めてである。またTAT膜透過反応においてMPIaseは基質の膜へのターゲティングに関与しているというデータも得られた。基質のシグナル配列を認識すると従来報告されてきたTatCを欠損させた株を用い、細胞質に蓄積するであろう前駆体SufIの精製を試みたが、TatC欠損株でもSufIは細胞質膜上に局在していた。一方MPIase枯渇株では、前駆体SufIは細胞質膜上には局在せず、細胞質に蓄積していた。この結果は、TatCではなくMPIaseが基質の膜ターゲティングに関与していることを示唆している。さらに、膜透過が阻害されるシグナル配列の変異体であるSufI (KK) でもMPIaseが存在する内膜への局在が観察された。一連の結果から、MPIaseは細胞質膜上でTAT基質前駆体を受容するが、そのシグナル配列が機能的であるかどうかを識別することはできず、MPIaseによって膜挿入された基質シグナル配列のRR残基をTatCが認識することでTAT膜透過反応がスタートするという新たな膜透過モデルを提唱できる。