Ｇ蛋白共役型受容体を介した新規脳内ストレス応答因子の探索

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本研究では、脳内でのバソプレッシン受容体を介したストレス応答機構の存在と神経伝達反応に関わる物質を明らかにする。これまで、分泌および膜タンパク質の細胞内外への移行と細胞内局在を指標にしながら、培養細胞を使って細胞外刺激に対する受容体シグナル因子の応答とタンパク質の極性移動を検証する系の構築を行った。また、薬剤刺激条件の検討や細胞膜や細胞小器官マーカータンパク質のクローニングを完了し、in vitro実験の基盤を固めてきた。本年度は、バソプレッシン刺激による受容体シグナル因子の変動を培養系にて同定することを試みるため、マウス脳のスライス培養法の構築を行った。3～4週齢のマウスを頸椎脱臼後、体幹より脱血してマウスの脳をHank’s液に採取した。氷冷しながらブレインスライサーに脳を定位置に保ちながら剃刃で剥切し、分界条床核付近の切片をインサートウェルに取り培養を開始した。途中、2～3日で培養液を交換し、培養開始から7日目で培養脳切片に刺激を行った。刺激は10-6 M濃度のバソプレッシンと、20 mM KClとした。切片を4% PFA/0.1 M PBで室温30分固定し、20% ショ糖に置換して包埋材に包埋し、凍結ブロックを作成した。凍結切片を作成した後、早期応答因子c-fosを指標としてバソプレッシンおよびKClの刺激に培養脳切片に対する応答性を見ることで細胞の生存確認を行い、KClに刺激応答反応が認められる培養条件を確立することができた。今後、組織外刺激に対する至適条件の決定や、脳内で神経伝達物質あるいはその合成酵素とAVP受容体の共局在を調べることは未だ検討の余地があり、取り組むべき課題と考えている。これらの検討を重ねてバソプレッシンとストレス応答機構との関連性解明を目指していく。