Ultrafast spectroscopy of single photoresponsive proteins under fluctuation

タンパク質の様な巨大な複雑分子はマイクロ秒からミリ秒スケールでの遅い大きな構造揺らぎを示す。光応答性タンパク質においては、こうした揺らぎに応答して内包された発色団分子の性質や局所環境、さらにはその反応性が大きく影響される。こうした揺らぎに応答して変遷する発色団の反応性を明らかにすることはその機能発現機構を理解するために欠かすことができないが、系のアンサンブル平均を観測する従来の時間分解分光法ではこれらの情報を得ることはできない。そこで、本研究では単一分子からの蛍光をプローブとする超高速分光装置を開発し、揺らぎとともに変遷する単一光応答性タンパク質の反応ダイナミクスの直接観測を目指している。本年度は、この単一光応答性タンパク質の対する超高速分光を行うための基盤となる、顕微分光光学系の立ち上げを遂行した。具体的には、新たに共焦点顕微鏡を構築し、単一光子検出器と時間相関単一光子計数モジュールを導入することで、顕微鏡下において蛍光検出に基づく単一分子観測を行うためのシステムを構築した。高出力・高繰返しフェムト秒Ybファイバーレーザーの第２高調波（515 nm, 260 fs）を励起光とし、蛍光色素ローダミン6Gを参照試料として用いることで、装置性能の評価と最適化に取り組んだ。nMオーダーの希薄溶液に対する蛍光寿命・蛍光相関分光測定を通じて、構築した装置が単一分子を観測するのに十分な検出感度を有することを確認した。

タンパク質の様な巨大な複雑分子はマイクロ秒からミリ秒スケールでの遅い大きな構造揺らぎを示す。光応答性タンパク質においては、こうした揺らぎに応答して内包された発色団分子の性質や局所環境、さらにはその反応性が大きく影響される。こうした揺らぎに応答して変遷する発色団の反応性を明らかにすることはその機能発現機構を理解するために欠かすことができないが、系のアンサンブル平均を観測する従来の時間分解分光法ではこれらの情報を得ることはできない。そこで、本研究では単一分子からの蛍光をプローブとする超高速分光装置を開発し、揺らぎとともに変遷する単一光応答性タンパク質の反応ダイナミクスの直接観測を目指している。本年度は、この単一光応答性タンパク質の対する超高速分光を行うための基盤となる、顕微分光光学系の立ち上げを遂行した。具体的には、新たに共焦点顕微鏡を構築し、単一光子検出器と時間相関単一光子計数モジュールを導入することで、顕微鏡下において蛍光検出に基づく単一分子観測を行うためのシステムを構築した。高出力・高繰返しフェムト秒Ybファイバーレーザーの第２高調波（515 nm, 260 fs）を励起光とし、蛍光色素ローダミン6Gを参照試料として用いることで、装置性能の評価と最適化に取り組んだ。nMオーダーの希薄溶液に対する蛍光寿命・蛍光相関分光測定を通じて、構築した装置が単一分子を観測するのに十分な検出感度を有することを確認した。