Elucidation of morphogenesis, maintenance and stabilization, and maintenance mechanism of glomerular podocytes by microtubule bundles

阐明微管束肾小球足细胞的形态发生、维持和稳定以及维持机制

基本信息

批准号：
21K19484
负责人：
竹居孝二
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

１．ダイナミン１による微小管制御：分化ポドサイトではダイナミン１が微小管を束化してポドサイトの突起形成に寄与することを発見し、精製ダイナミン１と微小管を試験管内で反応させると、ダイナミン１が微小管周囲に重合して微小管束を形成することを示した（La et al., FASEB J 2020）。さらに、合成ペプチドを用いた結合阻害実験によりダイナミン１PHドメインの微小管;管結合部位を特定した（Hori et al., eLife 2022）。吉川雅英博士（東京大）との共同研究により、ダイナミン１と微小管の超複合体のクライオ電子顕微鏡解析を実施した結果、ダイナミン１は脂質膜上と同様に微小管にらせん状に重合するが、微小管との結合は緩く、PHドメインの位置もフレキシブルであることが判った。２．ダイナミン２によるアクチン制御：ポドサイトは分化に伴いストレスファイバーの配向を再編させて、著しく伸展し、ダイナミン２は主要アクチン制御分子として働く。ダイナミン２の疾患変異K562Eは細胞内のストレスファイバーを減少させるが、アクチン線維束化能は保たれていることがin vitro 解析により判った(Hamasaki et al., Front Cell Dev Biol.2022)。成田哲博博士（名古屋大）との共同研究により、ダイナミン２がつくるアクチン線維束の立体構造解析に着手し、予備実験としてダイナミン２野生型及びK562Eによるアクチン線維束を比較した。野生型及びK562Eともに直径約50nmのアクチン線維束を形成した。K562Eではアクチン線維束が分散して観られたが、野生型ではアクチン線維束が複数集合し易くクライオ電子顕微鏡構造解析に適さないことが判明したので、構造解析の試料調製はダイナミン２K562Eによるアクチン線維束から開始することとした。

1。通过Dynamin 1：微管对照：我们发现Dynamin 1捆扎微管有助于分化的Podosites中的Podosite突起的形成，当纯化的Dynamin 1在试管中反应时，Dynamin 1在测试管中反应时，dynamin 1聚合在微管周围形成微管以形成微管（La et e et al。此外，使用合成肽的结合抑制实验用于鉴定动力蛋白1PH结构域的微管和管结合位点（Hori等，Elife，2022）。在与吉川玛利亚德（Yoshikawa Masahide）（东京大学）合作的情况下，我们对Dynamin 1和微管的超级复合物进行了冷冻电子显微镜分析，并发现Dynamin 1聚合在微型膜上聚集到微管中，但它与脂质膜上一样，但它与Microtubules的结合是柔软的，并且是柔韧性的。 2。动力蛋白2：肌动蛋白控制：足细胞重组具有分化并显着延伸的应激纤维的取向，而Dynamin 2充当了主要的肌动蛋白调节分子。 Dynamin 2疾病突变K562E降低了细胞内应激纤维，但体外分析表明，肌动蛋白引人入胜的能力得到了维持（Hamasaki等人，前细胞DevBiol。2022）。通过与Narita Tetsuhiro博士（名古屋大学）合作，我们开始分析Dynamin 2产生的肌动蛋白捆绑包的三维结构，作为初步实验，我们比较了由Dynamin 2野生型和K562E引起的肌动蛋白捆绑包。野生型和K562E均形成直径约50 nm的肌动蛋白纤维束。尽管在K562E中以分散形式观察到肌动蛋白纤维束，但发现多种肌动蛋白纤维束倾向于在野生型中组装，并且不适合冷冻电子显微镜结构分析，因此决定从肌动蛋白纤维束开始与Dynamin 2K562E进行结构分析的样品制备。