GVHD治療用MSCの品質評価を目的とした新規バイオアッセイ法の開発

开发用于 GVHD 治疗的 MSC 质量评估的新生物测定方法

基本信息

批准号：
21K12767
负责人：
草川森士
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Health Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

MLR試験での利用を想定したモデル細胞のスクリーニングを引き続き実施した。免疫応答を示すT細胞モデルとして、TALL-とMOLT-4を選定した。これらの細胞株はマイトジェンによる活性化反応を安定して示すことが見出された。並行して、MLR試験における被験細胞モデルの評価を行った。従来法MLRにて、MRC-5と不死化MSCがPBMCの増殖を抑制することを確認した。複数のPBMCロットへの影響を検討した結果、不死化MSCが安定してPBMCの増殖を抑えることが分かり、MLRにおけるポジコンとして有用であることが見出された。続いて、MLR試験における培養法の改良として、細胞を分散させるポリマー試薬を添加した培地と低接着容器を用いて構築される３次元環境下での細胞培養を検討した。ポリマー試薬の添加濃度、培養細胞の密度などの条件検討を実施した。さらに、MLR試験をイメージング技術によって定量的に評価する方法を検討した。TALL-1とMOLT-4それぞれに、増殖マーカーとして知られる細胞周期関連遺伝子のプロモーターとGFP遺伝子のノックインを施し、遺伝子改変細胞株を複数樹立した。さらに、遺伝子改変細胞株の特性解析を進め、ノックイン株において、細胞増殖・分裂に伴い、蛍光タンパク質が発現することを確認した。また、これら遺伝子改変細胞株を用い、シングルセルレベルで細胞を撮像するための培養容器の検討、撮像方法の検討、画像解析の検討も進めた。

筛选模型细胞在MLR测试中使用，然后进行。将高高和乳胶4选为显示免疫反应的T细胞模型。发现这些细胞系通过有丝分裂剂表现出稳定的激活反应。同时，评估了MLR检验中的测试细胞模型。常规MLR证实，MRC-5和永生的MSC抑制了PBMC的增殖。在检查了对多个PBMC批次的影响后，发现永生的MSC可以稳定抑制PBMC的增殖，并且它们在MLR中可用作正成分。接下来，作为MLR测试中培养方法的改进，使用含有聚合物试剂以分散细胞和低粘附容器的培养基研究了三维环境中的细胞培养。检查了添加聚合物试剂浓度和培养细胞密度等条件。此外，我们研究了一种使用成像技术定量评估MLR测试的方法。高-1和MOLT-4分别受到称为增殖标记和GFP基因敲入的细胞周期基因的启动子的启动子，并建立了几种遗传修饰的细胞系。此外，进行了遗传修饰的细胞系的表征，并证实荧光蛋白在具有细胞增殖和分裂的敲入线中表达。此外，使用这些转基因细胞系，我们还研究了在单细胞水平上成像细胞，检查成像方法和图像分析的培养容器。