熱帯樹木由来高活性イソプレン合成酵素の探索とハイブリッド型発酵用高機能酵素の開発

本研究では多様且つイソプレン合成が活発な熱帯植物のイソプレン合成酵素（IspS）を広範囲に探索し、高活性を実現する分子情報を解明し、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発を行うことを目的とする。R4年度は高活性、高基質親和性を可能とするIspSのコンセンサス配列の解明を行う計画であった。一般的に、優良酵素の探索には保存配列を標的にして目的の酵素の遺伝子クローニングを行い、組換え酵素を調製してその性質を解析する方法が用いられる。しかしながら、個々の樹木のIspSについて遺伝子クローニングを行い、組換え酵素の特性を解析する方法は多大の労力と時間を要し、広範な樹種の探索には適していない。これに対し、申請者が開発したPing Pong法は採取した切り枝の温度依存的なイソプレン放出を人工気象室内で測定するもので、わずか1日で温度応答性を評価することができ、極めて短期間で優良なIspSの供給源となる樹種の絞り込みが可能である。今年度はこれまでイソプレン放出測定が行われていない単子葉類に樹種範囲を拡大して、Ping Pong法でIspSの一次スクリーニングを行った。琉球大学構内にある12種の単子葉類のイソプレン放出の温度依存性を調べ、１０種（83％）がイソプレンを放出することを見出した。そのうち、ダンチクが最も高い温度依存性を示したので、IspSの遺伝子クローニングを試みた。IspSのコンセンサス配列を標的にしたRT-PCRにより、ダンチクIspSのコアー配列を得ることができた。ダンチク以外にミツヤヤシが特異な温度応答性を示したので、遺伝子クローニングの候補とした。次年度は、これらの樹種群のIspS遺伝子をクローニングして酵素学的特性を解析し、高機能酵素に特徴的なコンセンサスアミノ酸配列を明らかにする計画である。

本研究では多様且つイソプレン合成が活発な熱帯植物のイソプレン合成酵素（IspS）を広範囲に探索し、高活性を実現する分子情報を解明し、非石油資源の発酵系に適したハイブリッド型高機能IspSの設計・開発を行うことを目的とする。R4年度は高活性、高基質親和性を可能とするIspSのコンセンサス配列の解明を行う計画であった。一般的に、優良酵素の探索には保存配列を標的にして目的の酵素の遺伝子クローニングを行い、組換え酵素を調製してその性質を解析する方法が用いられる。しかしながら、個々の樹木のIspSについて遺伝子クローニングを行い、組換え酵素の特性を解析する方法は多大の労力と時間を要し、広範な樹種の探索には適していない。これに対し、申請者が開発したPing Pong法は採取した切り枝の温度依存的なイソプレン放出を人工気象室内で測定するもので、わずか1日で温度応答性を評価することができ、極めて短期間で優良なIspSの供給源となる樹種の絞り込みが可能である。今年度はこれまでイソプレン放出測定が行われていない単子葉類に樹種範囲を拡大して、Ping Pong法でIspSの一次スクリーニングを行った。琉球大学構内にある12種の単子葉類のイソプレン放出の温度依存性を調べ、１０種（83％）がイソプレンを放出することを見出した。そのうち、ダンチクが最も高い温度依存性を示したので、IspSの遺伝子クローニングを試みた。IspSのコンセンサス配列を標的にしたRT-PCRにより、ダンチクIspSのコアー配列を得ることができた。ダンチク以外にミツヤヤシが特異な温度応答性を示したので、遺伝子クローニングの候補とした。次年度は、これらの樹種群のIspS遺伝子をクローニングして酵素学的特性を解析し、高機能酵素に特徴的なコンセンサスアミノ酸配列を明らかにする計画である。