Studies on the efficient carbohydrate metabolic pathway: Screening and functional analysis of the key enzyme phosphorylase

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嫌気性微生物は，酸素を利用した効率的なATP生産を行なえないため，ATPの消費無しに糖質を分解・リン酸化できる糖質加リン酸分解酵素（ホスホリラーゼ）が関与する特徴的な糖代謝経路を有することがある。本研究では，ゲノム情報やメタゲノムライブラリーなどを利用しβ-ガラクトシドに作用するホスホリラーゼを網羅的に探索し，発見した酵素の機能特性を明らかにし，ホスホリラーゼを鍵酵素とする新規ATP消費抑制型β-ガラクトシド代謝経路の全容を解明を目指す。当年度は，（1）ゲノム情報を基盤とした網羅的なホスホリラーゼ探索，（2）ゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーの作製，（3）基質および炭素源とするβ-ガラクトオリゴ糖の調製について，当初予定通り検討を加えた。ゲノム情報から系統解析を行なうことにより既知酵素から進化学的に遠い遺伝子に注目し，網羅的にホスホリラーゼホモログ遺伝子を検索・クローニングした。その結果，機能未知タンパク質の取得に至ったが，当該酵素のアクセプター特異性を確認したところ，N-アセチルグルコサミンに最も作用したため，残念ながら既知ラクト-N-ビオースホスホリラーゼであると判断された。また，ホスホリラーゼ遺伝子を多く持つ微生物のゲノムDNAおよび環境中から回収したヘテロなゲノムDNAを断片化，クローン化することでゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーの調製手法が確立でき，スクリーニングステップへの展開が可能となった。次年度以降に必要となる各種β-ガラクトシドの調製に関しては，寒天をはじめとする各種β-ガラクトシドを加水分解することで，重合度はそろっていないものの粗オリゴ糖シラップを調製することができた。