Structural basis for activation of intramembrane proteases

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膜内切断プロテアーゼは疎水的な膜環境で特殊な加水分解を行うため、酵素学的には未知の点が多い。本研究では、認知症の原因となるアミロイドβペプチドを生成するγセクレターゼの活性化の分子機構を解明するために、Ⅰ. 酵母モデル系を活用したγセクレターゼ活性調節・基質認識機構の解明と、Ⅱ. γセクレターゼ活性化変異体のコンホメーション変化の解明を目的とした。令和４年度においては、Ⅰ.酵母モデル系を活用した研究では、１）アミロイド前駆体（APP）切断部位の近傍に、γセクレターゼによる切断効率を上昇させる切断感受性変異を同定した。同定した変異はアスパラギン酸もしくはプロリンへの置換変異であった。変異体を哺乳類細胞に導入して解析したところ、切断感受性変異は家族性アルツハイマー病（FAD）のAPP変異での切断異常を回復させ、特にプロリン変異はAβのトリミングを促進することで長鎖・高毒性Aβの割合を大幅に低下させた。２）γセクレターゼの触媒サブユニットであるプレセニリン（PS1）の活性化変異体とAPPの切断感受性変異との間の相互作用を解析し、基質結合ポケットにおけるイオン相互作用が重要であることを明らかにした。Ⅱ. γセクレターゼ活性化変異体の構造解析では、１）酵母モデル系で用いていた構成発現プロモーターをガラクトース誘導性プロモーターに変更して発現量を増加させ、γセクレターゼ大量発現系を構築した。２）Flagタグ（Pen2-Flag）抗体によるアフィニティ精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより均一な複合体に精製した後、負染色による透過型電子顕微鏡解析を行って粒子状態を確認した。γセクレターゼは、プレセニリン、ニカストリン、Aph1、Pen2の４つのサブユニットからなる。酵母大量発現系から精製したγセクレターゼはニカストリンの含量が低く、精製の過程でサブユニット構成が保てない可能性が示された。