semi-in vivo系でのコヒーシンによる染色体機能と高次構造制御機構の解明

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コヒーシン複合体は遺伝子の転写制御などの染色体機能と高次構造の制御に寄与しており、in vitro実験系においてはその分子活性も徐々に明らかとなってきている。一方で、コヒーシンが実際に細胞内の染色体上でどのようにその分子活性を発揮して機能しているのかは不明である。そこで、コヒーシンによる転写及び高次構造制御の詳細を調べるため、透過処理したヒト培養細胞において、コヒーシン欠損時の高次構造の解析を行なった。Micro-Cを用いた詳細な解析を行なったところ、透過処理を施した細胞においても一部のクロマチンループは維持されていること、これらのループはコヒーシンに依存することが明らかとなった。また、ATPase変異コヒーシンの局在をChIP-seqで解析したところ、この変異コヒーシンの局在はコヒーシンローダーの結合サイトに極めて限定されていることがわかった。これらの結果から、コヒーシンのATPase活性はローディングサイトからのコヒーシンのクロマチン上での移動に重要な役割を果たしていることが示唆された。今後はこのsemi-in vivo実験系において、コヒーシン欠損時にNTPsを添加して転写プロファイルを解析する。また、この時のRNAPIIの結合プロファイル及びクロマチンループについてもそれぞれ解析する。さらに、同様の解析をコヒーシン変異型についても行う。また、コヒーシンを欠損させて染色体を”コヒーシンフリー”の状態にした細胞において透過処理を施し、そこにコヒーシン、コヒーシンローダーを含む細胞の核抽出液、またはコヒーシンのリコンビナントタンパク質を添加して、染色体高次構造の再構築を試みる。