verification of the back-door model for actin phasphate release

昨年度は、高分解能繊維型コンフォメーションアクチンの結晶構造とそれに基づく量子化学計算をもとに、アクチンのATP加水分解機構を議論した論文「Structures and mechanisms of actin ATP hydrolysis」をPNAS発表した。また、Pi放出穴の蓋（バックドア）に相当するArg177が相互作用するHis161に注目し、その側鎖のフリッピングを制御するPro-rich-loopのアクチン変異体を調製して生化学実験・結晶構造解析を行い、論文「Mutagenic analysis of actin reveals the mechanism of His161 flipping that triggers ATP hydrolysis」を発表した。現在進行中の研究の進捗状況は以下の通り。1.アクチンの加水分解とPi放出の両方に影響を与えるであろうヌクレオチド結合カチオンがアクチン構造に与える影響を、SPring-8にて結晶構造解析を行って検討した。まだ、明瞭な結論はいられていない。2.既存の結晶構造をもとにPro-rich loopの形状を検討し、PＬ-F型とPＬ-G型があることを発見した。サイトカラシン-アクチンでは分子全体はG型であるにも関わらず、Pro-rich-loopはPＬ-F型であることを見つけた（全体構造と必ずしも対応しない）。MDシミュレーションを用いて、相補的ストランドの182-194のヘリックスが結合していないB端では、分子全体がF型でも、PＬ-G型になることを見出した。さらなる検討が必要である。また、アクチン発現系の改良のため、RosenらのNMRの論文にある、N末にHisタグとThymosin-beta4を付けてTEVで切るコンストラクトを調製し、可溶性発現アクチンが増加することを確認した。

昨年度は、高分解能繊維型コンフォメーションアクチンの結晶構造とそれに基づく量子化学計算をもとに、アクチンのATP加水分解機構を議論した論文「Structures and mechanisms of actin ATP hydrolysis」をPNAS発表した。また、Pi放出穴の蓋（バックドア）に相当するArg177が相互作用するHis161に注目し、その側鎖のフリッピングを制御するPro-rich-loopのアクチン変異体を調製して生化学実験・結晶構造解析を行い、論文「Mutagenic analysis of actin reveals the mechanism of His161 flipping that triggers ATP hydrolysis」を発表した。現在進行中の研究の進捗状況は以下の通り。1.アクチンの加水分解とPi放出の両方に影響を与えるであろうヌクレオチド結合カチオンがアクチン構造に与える影響を、SPring-8にて結晶構造解析を行って検討した。まだ、明瞭な結論はいられていない。2.既存の結晶構造をもとにPro-rich loopの形状を検討し、PＬ-F型とPＬ-G型があることを発見した。サイトカラシン-アクチンでは分子全体はG型であるにも関わらず、Pro-rich-loopはPＬ-F型であることを見つけた（全体構造と必ずしも対応しない）。MDシミュレーションを用いて、相補的ストランドの182-194のヘリックスが結合していないB端では、分子全体がF型でも、PＬ-G型になることを見出した。さらなる検討が必要である。また、アクチン発現系の改良のため、RosenらのNMRの論文にある、N末にHisタグとThymosin-beta4を付けてTEVで切るコンストラクトを調製し、可溶性発現アクチンが増加することを確認した。