Analysis of lipid domains around receptor tyrosine kinases by super-resolution microscopy

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過去の生化学的な解析から、受容体型チロシンキナーゼは、脂質ラフトに局在することが示唆されていた。本研究では、「脂質プローブ」と「超解像顕微鏡法」とを組み合わせることにより、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか、を明らかにすることを目的とする。本年度は、代表的な受容体型チロシンキナーゼであるEGFRが、どの脂質ドメインに存在するかを調べるために、EGFRと脂質プローブとの共局在解析を超解像顕微鏡によって行った。脂質プローブとして、SMに対してはEquinatoxin II、クラスター化したSMに対してはLysenin、SM/Chol複合体に対してはNakanori、Cholに対してはD4H、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PIP2) に対してはPLC delta-PH、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸 (PIP3) に対してはGRP1-PH、ホスファチジルセリン (PS) に対してはevectin2-PHを用いた。超解像顕微鏡の共局在率はRipley’s bivariate K-functionで評価した。その結果、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。ところが、EGF刺激後には共局在が低下することが分かった。一分子イメージング法でも検証した結果、同様の結果が得られた。この共局在の低下は、PLC gammaによって、EGFR周囲のPIP2が分解されるためであることが示唆された。また、EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについて、ヒトのcDNAから50種類以上をクローニングし、次年度以降の超解像顕微鏡による解析のための準備を行った。