蛍光アセチルコリンセンサーによる細胞内コリン伝達系の実証

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ムスカリン受容体を含むGタンパク質共役型受容体は、通常細胞の表面に局在し、細胞外からのリガンドを受容して活性化を受ける。我々はアセチルコリンをリガンドとするムスカリンM1受容体が細胞の内部にも局在し、活性化されうることを明らかにしている。この研究では、細胞の内部でムスカリンＭ１受容体が活性化される様子を直接的に検出する系を確立し、そのメカニズムの全容に迫る目的で行われた。細胞内で活性化される様子を検出するためにＭ１受容体に循環置換GFPを導入し、活性化に伴う蛍光の増加を呈するセンサーとした。今年度は、試験的に得られていたセンサーを改良し、細胞内局在性と活性化に伴う応答の安定した新しいセンサーを開発した。改良の際には、循環置換GFPの導入位置によって、蛍光変化量と細胞内局在性が大きく影響を受けることが分かり、結果的に多くの試作を行う必要が生じた。最終的に得られた同センサーを用いることで、細胞内Ｍ１受容体の活性化が、リガンドの細胞膜透過性の有無により影響を受けることを確認した。つまり、脂溶性が高く細胞膜を容易に透過するアゴニストは細胞内Ｍ１受容体を活性化し、水溶性が高く細胞膜透過性の低いアゴニストは細胞表面のＭ１受容体のみを活性化する。更に細胞膜透過性のない内因性リガンドであるアセチルコリンが、特定のトランスポーターによって細胞内へ輸送され、細胞内Ｍ１受容体を活性化する様子を確認した。更に、この活性化を可能とするトランスポーターについては、ヒトとマウスで一部異なる結果を得ており、現在その原因について解析を進めている。