糸状菌由来ビステトラヒドロフラン環構築に寄与する反復型酸素添加酵素の機能開拓

糸状菌由来フラビン依存酸素添加酵素（FMO）は、ユニークな反応を行う酵素として注目されてきている。一方、その機能開拓は、基質の酸化とフラビン還元の機能を両立させる必要があるために困難が伴う。本研究は、機能開拓が難しいscFMOを対象として、計算化学に基づいた活性に重要なアミノ酸残基の予測、in vitro解析の併用による機能同定と、単成分系FMOの二成分系FMOへの改変により機能開拓を目指す基礎研究と位置づけできる。本研究ではE. variecolor由来asteltoxinの生合成に関与するFMO（AstE）の機能同定と反応機構の解明、機能拡張を目指した。AstEは、asteltoxin生合成において、2段階のエポキシ化に関与することが予測される。この2つのエポキシ化段階において、関与するアミノ酸残基に違いがあるかについても調査する。今年度はin vitroによる活性評価系の確立を目指した。大腸菌と酵母のコドン使用頻度に最適化した人工遺伝子大腸菌とメタノール資化酵母の発現系について検討した。大腸菌の発現系ではタンパク質の発現が確認できなかったことから、酵母への発現系に切り替えて検討する。また、計算化学ソフトMOE（モルシス社）を利用したAstEの立体予測と、その結果に基づいて作成した点変異酵素の活性評価から、活性に重要なアミノ酸残基について推定した。AstE と補酵素FAD、推定中間体のドッキングシミュレーションを行い、FMOによるエポキシ化部分と補酵素の距離が近いモデルを選抜し、基質に近い酵素（活性中心）のアミノ酸残基を調査した。その結果、複数のアミノ酸残基の候補が上がった。なお、AstEは、2つの異なる生合成段階を酸化することが予想されたことから、それぞれの推定中間体について解析を行った。

糸状菌由来フラビン依存酸素添加酵素（FMO）は、ユニークな反応を行う酵素として注目されてきている。一方、その機能開拓は、基質の酸化とフラビン還元の機能を両立させる必要があるために困難が伴う。本研究は、機能開拓が難しいscFMOを対象として、計算化学に基づいた活性に重要なアミノ酸残基の予測、in vitro解析の併用による機能同定と、単成分系FMOの二成分系FMOへの改変により機能開拓を目指す基礎研究と位置づけできる。本研究ではE. variecolor由来asteltoxinの生合成に関与するFMO（AstE）の機能同定と反応機構の解明、機能拡張を目指した。AstEは、asteltoxin生合成において、2段階のエポキシ化に関与することが予測される。この2つのエポキシ化段階において、関与するアミノ酸残基に違いがあるかについても調査する。今年度はin vitroによる活性評価系の確立を目指した。大腸菌と酵母のコドン使用頻度に最適化した人工遺伝子大腸菌とメタノール資化酵母の発現系について検討した。大腸菌の発現系ではタンパク質の発現が確認できなかったことから、酵母への発現系に切り替えて検討する。また、計算化学ソフトMOE（モルシス社）を利用したAstEの立体予測と、その結果に基づいて作成した点変異酵素の活性評価から、活性に重要なアミノ酸残基について推定した。AstE と補酵素FAD、推定中間体のドッキングシミュレーションを行い、FMOによるエポキシ化部分と補酵素の距離が近いモデルを選抜し、基質に近い酵素（活性中心）のアミノ酸残基を調査した。その結果、複数のアミノ酸残基の候補が上がった。なお、AstEは、2つの異なる生合成段階を酸化することが予想されたことから、それぞれの推定中間体について解析を行った。