糸状菌由来ビステトラヒドロフラン環構築に寄与する反復型酸素添加酵素の機能開拓

有助于丝状真菌双四氢呋喃环构建的重复加氧酶的功能发育

• 批准号: 22K06687
• 负责人: 橋元 誠
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Musashino University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06687/
• 关键词: 生合成; 糸状菌; 二次代謝産物; フラビン依存酸素添加酵素

糸状菌由来フラビン依存酸素添加酵素（FMO）は、ユニークな反応を行う酵素として注目されてきている。一方、その機能開拓は、基質の酸化とフラビン還元の機能を両立させる必要があるために困難が伴う。本研究は、機能開拓が難しいscFMOを対象として、計算化学に基づいた活性に重要なアミノ酸残基の予測、in vitro解析の併用による機能同定と、単成分系FMOの二成分系FMOへの改変により機能開拓を目指す基礎研究と位置づけできる。本研究ではE. variecolor由来asteltoxinの生合成に関与するFMO（AstE）の機能同定と反応機構の解明、機能拡張を目指した。AstEは、asteltoxin生合成において、2段階のエポキシ化に関与することが予測される。この2つのエポキシ化段階において、関与するアミノ酸残基に違いがあるかについても調査する。今年度はin vitroによる活性評価系の確立を目指した。大腸菌と酵母のコドン使用頻度に最適化した人工遺伝子大腸菌とメタノール資化酵母の発現系について検討した。大腸菌の発現系ではタンパク質の発現が確認できなかったことから、酵母への発現系に切り替えて検討する。また、計算化学ソフトMOE（モルシス社）を利用したAstEの立体予測と、その結果に基づいて作成した点変異酵素の活性評価から、活性に重要なアミノ酸残基について推定した。AstE と補酵素FAD、推定中間体のドッキングシミュレーションを行い、FMOによるエポキシ化部分と補酵素の距離が近いモデルを選抜し、基質に近い酵素（活性中心）のアミノ酸残基を調査した。その結果、複数のアミノ酸残基の候補が上がった。なお、AstEは、2つの異なる生合成段階を酸化することが予想されたことから、それぞれの推定中間体について解析を行った。

The cause of the fungus is the addition of acid-dependent enzymes (FMO), the reverse enzyme activity, the concentration of enzymes, the concentration of enzymes, the concentration of enzymes. One party, the machine can start the development, the basic acidizing system, and the machine can make sure that it is necessary to make sure that the company is in trouble. In this study, the development of the scFMO system, the calculation of the activity of the chemical base, the determination of the important acid residues in the in vitro, the determination of the energy of the two components of the FMO system, the improvement of the FMO system, and the development of the mechanism, the location of the chemical base, the location of the chemical base, the chemical base and the activity of the chemical base were calculated. In this study, E. variecolor is derived from the fact that the asteltoxin synthetic system and the system FMO (AstE) machine can verify the interpretation of the anti-mechanism and the ability of the target system. AstE and asteltoxin were synthesized and synthesized, and two segments were synthesized. In the second part of this paper, the acid residues were changed in the first place, and the acid residues were not changed. This year's in vitro activity is to ensure that the target is established. Bacillus thuringiensis yeast strains are used to optimize artificial bacteria, artificial bacteria, yeast strains, yeast strains. Please make sure that the bacteria and yeast are cut in place of the bacteria. In this paper, MOE is used to calculate the activity of enzymes, which is important for the presumption of acid residues. The results show that the enzyme activity is very important, and the enzyme activity is very important. The results show that the enzyme activity is very important, and the activity is very important. The AstE enzyme FAD, the presumption that the body contains the enzyme, the enzyme in the presumption, the partial enzyme in the FMO, the enzyme, the enzyme, the enzyme (active center), the acid residue, the acid residue. The results and complex numbers show that the acid residues are on the waiting list. In the presumption of the composition of the synthetic segment, the acidizing effect is expected to occur in the presumption that the body is parsed in the presumption, AstE, 2, 2, 4, 2, 4, 2, 4, 2, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4,