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ヒト化ボツリヌス毒素抗体の抗体医薬品としての応用

人源化肉毒毒素抗体作为抗体药物的应用

基本信息

批准号：
22K07055
负责人：
幸田知子
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Osaka Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

申請者が所属する研究室で開発された抗ボツリヌスE型神経毒素（BoNT/E）完全ヒト化モノクローナル抗体（hmE9-4）は、BoNT/Eの酵素活性ドメインである軽鎖（L/E）を認識し、単独、かつ、ごく低用量でBoNT/Eの毒素活性を中和する。hmE9-4のBoNT/E毒素中和機構を明らかにするために本年度は、ELISAとhmE9-4のエピトープに関わる領域の同定とhmE9-4とL/Eの分子間相互作用をELISAと等温滴定型カロリメトリー（ITC）により測定した。L/EとｈｍE9-4の構造情報を基にしたドッキングシミュレーションソフトから予想された領域2か所（m2, m3）とL/Eの疎水性ポケットの一つで234-244までの連続した領域で250 loopと呼ばれる不安定で結晶化されない部分（m4, m5, m6）をターゲットとした。さらにL/Eの酵素活性中心である亜鉛結合モチーフの点変異体（m8）を加えて合計7つのL/E変異体を作製した。野生型L/Eおよび変異体L/Eを抗原とし、ELISAを行った。hmE9-4を1次抗体、2次抗体に検出用のgoat anti-human IgGを反応させ、基質を発色させた。m3だけが優位に結合の低下が見られた。さらに、hmE9-4とL/E分子間の相互作用をITCで測定した。1 μMのL/Eに対し、10 μMのhmE9-4をリガンドとし滴下すると発熱が観察され飽和状態に達した。ｈｍE9-4 1分子に2分子のL/Eが結合し、解離定数は約0.57 x 10^10 Mと高く、イオン結合や水素結合によって起こるエンタルピー変化であることが分かった。また、m3 L/Eの解離定数は、約16.0 x 10^10 Mで、野生型L/Eがm3 L/EよりもhmE9-4に対し高い結合親和性を持っており、ELISAの結果と一致した。

The applicant's laboratory has developed an antibody (hmE9-4) against the complete conversion of BoNT/E, and the enzyme activity of BoNT/E is recognized, isolated, and neutralized at low doses. hmE9 -4 and BoNT/E toxin neutralization mechanism is determined by ELISA and ITC. The structural information of L/E and hmE9-4 is based on the structure information of L/E 9 -4. The structure information of L/E 9 - 4 is based on the structure information of L/E 9 - 4. The enzyme activity center of L/E is controlled by the addition of 7 L/E variants. wild-type L/E and allogeneic L/E hmE9 -4: goat anti-human IgG for primary antibody and secondary antibody detection M3 is the best combination of low and high. The molecular interaction between hmE9 -4 and L/E was determined by ITC. 1 μM L/E ratio, 10 μM hmE9 -4 ratio, and the saturation state were observed. hmE9-4 1 molecule 2 molecules L/E binding, dissociation constant is about 0.57 x 10^10 M, high, high The binding affinity of wild type L/E was about 16.0 x 10^10 M. The binding affinity of wild type L/E was about 16.0 x 10^10 M.