Elucidation of the mechanism of protein homeostasis disruption in autophagy-related neuromuscular diseases

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オートファジー異常を来す神経筋疾患の代表的疾患であるDanon病は、リソソーム膜蛋白であるLAMP-2欠損症で、ミオパチーと致死性心筋症を呈する治療未確立の予後不良な疾患である。原発性リソソーム機能異常からオートファジー機構の異常を来す。LAMP-2欠損ではG3BP1（Ras GTPase-activating protein-binding proteins 1）を介したmTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1）のオートファジー制御シグナルに異常をきたすことが知られているが、その機序は明らかでない。オートファジーと相分離が多様な疾患発症に関与することを踏まえ、オートファジーでのLAMP-2複合体の形成機序とその制御破綻について解明を目指した。2022年度は、分子レベルでのオートファジー異常の解析として、LAMP-2複合体の構成因子の分子間相互作用の生化学的評価を行った。LAMP-2Bフラグメントのコンストラクトを設計し、大腸菌BL21(DE）株で誘導発現し目的蛋白質を精製した。さらに、プルダウンアッセイや共免疫沈降法を用いて、LAMP-2複合体の構成因子の分子間相互作用を生化学的に評価した。近接依存性標識法でLAMP-2の相互作用因子の分析も行った。結果として、LAMP-2とG3BP1の直接的な相互作用は確認できず、LAMP-2複合体への他因子の関与が示唆された。一方、近接依存性標識法では細胞内でLAMP-2に近接するビオチン化蛋白が確認でき、オートファジー制御に関与する複合体構成因子が含まれる可能性が考慮された。本結果からは、相分離因子であるG3BP1とLAMP-2の相互作用は確認できなかったが、オートファジー制御に関与するLAMP-2複合体構成因子の存在を指摘できた。